精子发生相关基因SOX30基因在人前列腺癌组织中的表达及其临床意义*

王 翰唐爱发

1. 安徽医科大学（安徽合肥 230031）；2. 深圳市第二人民医院

精子发生相关基因SOX30基因在人前列腺癌组织中的表达及其临床意义*

王 翰1,2唐爱发2**

1. 安徽医科大学（安徽合肥 230031）；2. 深圳市第二人民医院

目的 研究SRY box containing gene 30（SOX30）基因在前列腺癌组织中表达情况，并且分析SOX30的表达与前列腺癌临床病理特征之间的相关性；并检测SOX30在前列腺癌细胞PC3、DU145、LNCaP以及正常人前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达情况。方法 采用免疫组织化学方法检测SOX30在前列腺癌组织中表达特点，采用逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白印迹法（Western Blotting）分析SOX30在PC3、DU145、LNCaP以及正常人前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达情况，运用统计学方法分析SOX30蛋白表达量与前列腺癌临床病理特征之间的关系。结果 在123例前列腺癌中，68例（55.28%）发生SOX30表达缺失，并且SOX30表达缺失与前列腺分期（P=0.001）、Gleason评分（P＜0.001）有明显的相关性；与正常人前列腺上皮细胞RWPE-1相比，SOX30在PC3、DU145、LNCaP中表达明显降低。结论 SOX30可能是作为一个肿瘤抑制基因在前列腺癌的发生发展中起着重要作用。

前列腺肿瘤; 免疫组织化学; 基因, 肿瘤抑制

SOX30基因是SOX基因家族成员之一，最早是在人和小鼠体内被分离出来并广泛存在于自然界动物体内，隶属于SOX基因家族H类，也是H类唯一的基因。SOX基因家族基于基因结构层次的不同和组织相似性等特点可以分为10组， 分别以A~J字母命名[1]。SOX30参与哺乳动物精原干细胞分化和精子发生[2,3]。在小鼠睾丸早期发育时SOX30开始表达，在睾丸发育成熟时SOX30表达明显增加，并且SOX30表达受DNA甲基化水平调控，并且这种调控表达模式与小鼠的精子发生及睾丸发育相关[4]，因此是一种精子发生相关基因。但目前尚未见有关SOX30基因在人前列腺癌中的研究报道。本研究应用免疫组织化学方法检测SOX30在123例前列腺癌中的表达特点并分析其表达与前列腺癌临床病理特征之间的关系，分析SOX30在前列腺癌细胞中的表达特点，为研究前列腺癌发生机制提供一定的理论依据。

材料与方法

一、材料

本实验前列腺癌细胞PC3、DU145、LNCaP以及正常人前列腺上皮细胞RWPE-1均购置于美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC），胎牛血清、RMPI-1640、DMEM购自GIBCO公司，RNA提取试剂盒购自日本Takara公司，SOX30基因以及内参引物均购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自QIAGEN公司，SYBR Premix Taq Ⅱ购置于中国的宝生物工程（大连）有限公司，SOX30抗体、Tubulin抗体以及二抗均购置于Abcam。免疫组化芯片购自美国Biomax，其中可用前列腺癌组织123例。

二、实验步骤

（一）免疫组织化学染色

实验所用组织芯片首先经过100%的二甲苯浸泡进行脱蜡，之后依次浸泡于100%、95%、85%和80%的乙醇中，时间分别为15min、5min、5min、5min，接着将芯片浸泡于0.3%H2O2甲醇中封闭25min，0.01mol/L枸橼酸缓冲液进行抗原修复，PBS缓冲液清洗2min滴加BSA封闭，室温孵育25min，洗掉BSA封闭液加SOX30抗体（1:500）4℃过夜，PBS缓冲液清洗加羊抗兔IgG，37℃孵育1h，苏木精染色镜下观察。

（二）RNA提取和cDNA合成

依照总RNA提取试剂盒使用说明书分别提取PC3、DU145、LNCaP、RWPE-1 4株细胞的总RNA，之后使用反转录试剂盒中的gDNA去除液去除基因组DNA，总RNA反转成体系为20μL单链cDNA。

（三）实时荧光定量聚合酶链式反应

反应总体系20μL：10μL的SYBR Premix，2μL的cDNA，7μL的水，0.5μL的上游引物以及0.5μL的下游引物，加好后混匀上机。设置程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，40个循环，60℃退火1min，72℃延伸30s。引物序列见表1。

表1 引物序列

（四）Western Blotting

使用蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂按照100:1的比例分别提取4株细胞的蛋白，测量蛋白浓度后每个样品含蛋白20μg，配置10 %的凝胶进行SDS-PAGE电泳，在目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上结束。使用PVDF膜半干转，110 V 1.5h，5 %的脱脂牛奶封闭1h，TBST清洗3遍，每遍5 min，后加一抗SOX30抗体（1:2000，兔抗），4℃孵育过夜，而后吸掉一抗用PBST或TBST漂洗膜后再浸洗3次，5~10min/次，根据一抗来源选择合适的二抗（鼠抗兔），根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇1h，加二抗常温孵育1h，二抗孵育结束后，用PBST或TBST漂洗膜后再浸洗3次，5~10min/次。

结 果

一、SOX30在前列腺癌组织中的表达

石蜡包埋的前列腺癌组织芯片123例，利用免疫组化分析SOX30在前列腺癌组织中的表达，使用正常前列腺组织切片作为SOX30阳性表达对照（图1，图2，图3），发现在123例前列腺癌组织中，有68例（55.28%）SOX30表达缺失，55例呈弱阳性表达，SOX30表达缺失与临床病理分期的关系：Ⅰ期为33.3%（4/12），Ⅱ期为37.5%（18/48），Ⅲ期为74.4%（32/43），Ⅳ期为70.0%（14/20），Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期比较，差异有统计学意义（P=0.001）；与Gleason评分的关系：＜6分为0（0/8），=7分为49.2%（32/65），≥8分为72.0%（36/50），组间差异明显（P＜0.001）。而SOX30表达缺失与年龄、淋巴转移无明显相关性（P＞0.05），（表2）。

图1SOX30在前列腺组织中阳性表达（DAB×20），标尺：200μm

图2SOX30在前列腺癌组织中的弱阳性表达（DAB×20），标尺：200μm

图3SOX30在前列腺癌组织中的阴性表达（DAB×20），标尺：200μm

表2 SOX30蛋白表达与前列腺癌临床病理特征关系

二、SOX30在细胞系中的表达水平

实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示，采用比较 Ct 值方法（2-△△Ct）计算SOX30在4株细胞系中的表达量，与RWPE-1相比，SOX30在PC3、DU145、LNCaP明显降低，在RWPE-1、PC3、DU145、LNCaP中SOX30表达量分别为1±0.042；0.109±0.038；0.192±0.019；0.378±0.024（图4）。在Western blot实验中，SOX30蛋白表达与mRNA水平表达一致，与RWPE-1相比，SOX30在PC3、DU145、LNCaP明显降低（图5）。

图4SOX30在RWPE-1、PC3、DU145、LNCaP细胞中的mRNA表达水平

图5SOX30在RWPE-1、PC3、DU145、LNCaP细胞中的蛋白表达水平

讨 论

前列腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其致死率在美国居男性肿瘤第二位。2016年美国大约有180 890例新发病例，约26 120例男性前列腺癌患者死亡[5-7]。前列腺癌早期并无明显症状，但是后期会转移到其他部位例如肝脏、淋巴结以及最常见的骨转移。临床上常用的治疗方法是手术切除前列腺癌组织、放疗以及临床观察，这些治疗方法通常适合原位癌并且需要考虑到许多因素，包括年龄、预期寿命、Gleason评分、PSA和肿瘤大小[8]。而转移性前列腺癌必要时需要进行去势手术，或者合并使用促黄体激素释放激素或者拮抗剂，然而这样的治疗措施也只是暂时缓解症状，后期都将发展成去势抵抗性前列腺癌而死亡[9]。因此，探究前列腺癌的发病机制，寻找有效的前列腺癌早期诊断方法和治疗方法是当前迫切需要解决的问题。SOX30基因是SOX基因家族成员之一，SOX基因是指基因结构含有高迁移率组结构域（HMG）与哺乳动物睾丸决定性基因（Sry）类似的基因[10,11]。目前SOX基因家族约有30个成员，基于不同层次的结构和组织相似性等特征，将30个基因分成A~J 10个组别，同一组别的基因含有相似的HMG-box[11,12]。部分SOX蛋白如SOX2、SOX3、SOX11等只有一个外显子编码区域，而SOX6、SOX9、SOX30含有多个外显子[14-16]，而且SOX基因并不是集中在同一条染色体上而是在不同的染色体上。除了Sry和SOX3分别位于Y染色体和X染色体上，其他SOX基因都位于常染色体。SOX30是H组唯一的一个基因，目前已在人和多种动物体内发现该基因，编码的蛋白质作为转录调节因子调控胚胎发育。它可以激活p53基因的转录促进肺癌细胞凋亡，该蛋白还可能参与发育雄性生殖细胞的分化，该基因的选择性剪接可产生多个转录变异体[13]。目前SOX30在肿瘤的研究报道很少，Han等发现SOX30作为一种新型的选择性甲基化基因在肺癌中起着重要作用，SOX30转录缺失与甲基化有关，在肺癌中过表达SOX30基因抑制肿瘤细胞的增殖促进凋亡，p53基因是SOX30在肺癌中的下游的靶基因，SOX30可能与P53启动子区域CACTTTG（+115~+121）结合产生作用[17]，而在前列腺癌中未见报道。本实验结果显示，在前列腺癌细胞中SOX30表达明显降低，SOX30在前列腺癌组织中表达明显缺失或降低，并且与前列腺癌的临床病理分期相关，Ⅲ期、Ⅳ期的SOX30的表达缺失明显高于Ⅰ期、Ⅱ期，差异具统计学意义（P=0.001），也与Gleason评分相关（P＜0.001），这提示SOX30的表达缺失可能与前列腺癌的临床进展有关；随着Gleason评分的升高，SOX30表达缺失也呈上升趋势，提示SOX30表达缺失可能与前列腺癌临床分化程度有关，提示SOX30在前列腺癌中可能起着抑制前列腺癌进展的角色，但其具体机制有待进一步研究证实。

本研究首次证实SOX30在前列腺癌细胞和组织中表达下降或缺失，并且与临床病理分期和组织分级密切相关，提示SOX30可能与前列腺癌临床进展有关，而本实验只是初步验证SOX30在前列腺癌中的表达，其在前列腺癌癌中的功能以及具体作用机制有待进一步研究。

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（2016-12-22收稿）

Expression of spermatogenesis related gene SOX30 in human prostate cancer and its clinical signi fi cance*

Wang Han1,2, Tang Aifa2**
1. Anhui Medical University, Hefei 230031 Anhui, China; 2. Shenzhen Second People's Hospital Shenzhen Corresponding author: Tang Aifa, E-mail: tangaifa2004@163.com

Objective To investigate the expression of SRY box containing gene 30 (SOX30) gene in prostate cancer tissues and analyze the relationship between SOX30 expression and clinicopathological characteristics; the expressions of SOX30 were detected in prostate cancer cells PC3, DU145, LNCaP and prostate epithelial cell RWPE-1;Methods Immunohistochemical was used to detect the expression of SOX30 in prostate cancer tissues; Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction and Western blotting were used to analyze SOX30 expressions in prostate cancer cells PC3, DU145, LNCaP and prostate epithelial cells RWPE-1; The relationship between the expression of SOX30 protein and clinicopathological features was analyzed by statistical methods.Results The expressions of SOX30 were absent in 68 cases (55.28%), and the expression of SOX30 was signi fi cantly correlated with the stage of prostate (P=0.001) and Gleason score (P<0.001) in 123 cases of prostate cancer; the expressions of SOX30 in PC3, DU145 and LNCaP were signi fi cantly lower than that in RWPE-1.Conclusion SOX30 may be a tumor suppressor gene, which plays an important role in the development of prostate cancer.

prostatic neoplasms; immunohistochemistry; gene, tumor suppressor

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.003

R 737.25

项目： 本课题受深圳市科技计划项目（No.JSGG 201603011 62913 683和JCYJ20130329104732074）和深圳市高水平大学医学学科建设专项资金资助**

,E-mail: tangaifa2004@163.com