疏肝养血法对ED大鼠阴茎海绵体CaV1、3及RyR1蛋白表达的影响

张培海黄晓朋,蔡 剑尹 静李广森俞旭君常德贵陈帝昂**

1. 成都中医药大学附属医院男科（成都 610075）；2. 四川省中西医结合医院；3. 成都中医药大学；4. 成都中医药大学第二附属医院男科

疏肝养血法对ED大鼠阴茎海绵体CaV1、3及RyR1蛋白表达的影响

张培海1黄晓朋1,3蔡 剑1尹 静2李广森1俞旭君4常德贵4陈帝昂3**

1. 成都中医药大学附属医院男科（成都 610075）；2. 四川省中西医结合医院；3. 成都中医药大学；4. 成都中医药大学第二附属医院男科

目的 基于“肝藏”理论，通过对肝郁血虚ED大鼠的观察，探讨“疏肝养血法”调控阴茎海绵体平滑肌的物质基础与效应机制。方法 将30只SD大鼠随机分3组，即空白组、模型组、治疗组，每组各10只。治疗组予以四物汤加逍遥散合方治疗，空白组、模型组给予等体积生理盐水，连续14d。观察大鼠性活动情况、阴茎海绵体平滑肌形态及钙离子通道蛋白CaV1.3、RyR1的表达。结果 （1）与空白组比较，模型组大鼠性活动能力明显减弱，即骑跨潜伏期[（158.16±27.42）s]、插入潜伏期[（525.23±105.56）s]延长，骑跨次数[35.31±6.17]与插入次数[8.84±1.48]明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组骑跨潜伏期[（96.07±18.26）s]、插入潜伏期[（310.27±104.24）s]缩短，骑跨次数[49.6±18.65]与插入次数[15.21±4.63]显著改善（P＜0.05）。（2）各组阴茎海绵体平滑肌病理切片HE染色后，形态学改变不明显（P＞0.05）。（3）与空白组比较，模型组大鼠阴茎海绵体平滑肌CaV1.3[22059.51±10945.64]及RyR1蛋白[25053.70±2941.02]表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组CaV1.3[42386.31±9515.26]及RyR1蛋白[38038.25±4980.82]表达显著改善（P＜0.05）。结论 疏肝养血法可显著改善肝郁血虚ED大鼠阴茎组织Ca2+通道蛋白CaV1.3及RyR1的表达，可能是“肝藏”的理论物质基础及效应机制的重要环节。

肝藏血; 疏肝; 血虚; 阴茎

勃起功能障碍（erectile dysfunction, ED）是临床的常见病、多发病，发病率高，与心脏病、中风、糖尿病等疾病密切相关，严重影响男性的身心健康[1]。祖国医学认为该病多与肾相关。我们前期研究表明，肝在ED发病中具有重要的作用，且从肝论治ED效佳[2]；可改善阴茎海绵体组织中5-磷酸二酯酶（PDE5）活性、一氧化氮合成酶（nNOS）活性[3,4]。传统中医“肝藏”理论认为肝主藏血，可贮存和调节血液运行，阴茎勃起的基础是肝血的充盈。肝主疏泄，肝气充盈则阴茎勃起有力。肝体阴而用阳，肝血足则能涵养肝体，维持肝之正常疏泄。又因气为血帅，气行则血行，肝气条达，则血行畅达；若肝失疏泄，气行不畅，则血行亦不畅，血不能充养阴器则阴茎痿软。可见，肝与阴茎勃起功能关系密切。有学者提出“肝藏”的生理解剖基础是人体平滑肌系统[5]，且阴茎的勃起由平滑肌完成，是“肝行肾气”的体现[6-8]。本研究以此为切入点，通过观察疏肝养血法对大鼠阴茎海绵体平滑肌Ca2+通道蛋白CaV1.3及RyR1的表达，为进一步深入研究“肝藏”理论的阴茎勃起物质基础与效应机制奠定基础。

材料与方法

一、实验材料

（一）实验动物

雄性成熟SD大鼠30只，雌性10只，由成都达硕生物科技有限公司提供（川2013-24），经交配后均有正常勃起。适应性驯养1周后使用。

（二）主要实验设备

OLYMPUS倒置显微镜、Motic BA400显微摄像系统、Image-Pro Plus图像分析系统。

（三）实验药物制备

四物汤、逍遥散参照方剂学教材确定剂量。药物置于容器中加8倍量水浓缩为1:1（即每毫升药液含原生药1g）药液，4℃冰箱保存备用。

二、实验方法

（一）实验分组

随机将雄性成熟SD大鼠分为3组，即空白组、模型组、治疗组，每组各10只。

（二）模型建立

参考采用尾部放血和悬吊激惹方法配合低铁饮食制备肝郁血虚ED大鼠模型[9,10]。悬吊激惹每天一次，连续14d，每次30min，以后每2天增加10min。各处理组大鼠从造模第1天到第15天均饲喂低铁饲料。

（三）给药方案

造模第1天，悬吊结束后1h，治疗组给予灌胃四物汤与逍遥散合方煎剂12.96g/kg；空白组、模型组予等体积生理盐水灌胃，每天一次，连续14d。

（四）取材及检测指标

1. 阴茎海绵体组织标本制备：取下腹正中低位切口解剖出阴茎组织，在冰上快速分离阴茎海绵体组织后置入10%中性甲醛中固定。经过切片、HE染色等相关流程完成标本制备。

2. 大鼠性活动能力观察：造模第16天，将1只雄鼠单独置于一空笼中适应10min后，再投入1只雌鼠，观察雄鼠的性行为。计时骑跨潜伏期与插入潜伏期，计算骑跨次数与插入次数。

3. 免疫组织化学S-P法检测阴茎组织CaV1.3、RyR1蛋白表达水平：免疫组织化学S-P法具体检测步骤参照说明书进行。

三、统计学分析

所有数据均用SPSS 13.0软件包进行处理，各项指标结果用均数±标准差（x±s）表示，各组数据先进行正态分布检验，组间比较用两组独立样本的t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、阴茎平滑肌形态学

如图1所示，光镜下观察,各组大鼠阴茎海绵体平滑肌HE染色后，阴茎平滑肌结构改变不明显。

二、大鼠性活动情况

表1显示：与空白组比，模型组骑跨潜伏期、插入潜伏期显著延长，骑跨次数与插入次数明显减少，雄性大鼠的性能力显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，治疗组大鼠的性能力显著改善（P＜0.05）。

三、阴茎海绵体平滑肌组织CaV1.3和RyR1蛋白表达

表2显示：与空白组相比，模型组Cav1.3和RyR1蛋白积分光密度明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，治疗组能有效升高Cav1.3和RyR1蛋白积分光密度（P＜0.05）。

图1 阴茎平滑肌病理 （HE，×100）A：空白组；B：模型组；C：治疗组

表1 各组大鼠性活动情况（x±s）

表2 各组阴茎平滑肌组织Cav1.3、RyR1蛋白积分光密度的表达（±s）

表2 各组阴茎平滑肌组织Cav1.3、RyR1蛋白积分光密度的表达（±s）

注：与空白组比较：▲P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05

组别nCav1.3积分光密度RyR1积分光密度空白组653268.98±14033.5262893.19±9084.99模型组622059.51±10945.64▲25053.70±2941.02▲治疗组642386.31±9515.26*38038.25±4980.82*

讨 论

研究显示,约有17.1%的成年男性都患有ED，发病率与年龄显著相关[11]。ED对患者家庭生活质量有严重影响，已成为社会公共卫生问题之一[12]。ED属于中医的“阳痿”范畴，多数医家认为ED病机多与肾虚、肝郁、湿热、血瘀有关。张强等对发病规律进行大样本量研究，证实肝、肾两经的临床表现在伴随症状中占绝大多数，且以肝经多见[13]。绝大多数（91.89%）古代医家仍是直接或间接的从肾论治[14]。近年来，肝郁的作用越来越引起大家的重视[15]，被认为与ED的发病密切相关。

研究显示，勃起本质是一系列神经血管活动。NO-cGMP信号通路是发病的关键，NO进入阴茎海绵体平滑肌细胞后，激活Ca2+通道，让Ca2+迅速流入细胞内质网，平滑肌松弛勃起。Ca2+通道介导的Ca2+释放异常可能是血管平滑肌的舒张功能障碍的重要原因[16]。调控阴茎海绵体平滑肌细胞内Ca2+浓度的RyR主要为RyR1亚型，阴茎海绵体平滑肌RyR1功能异常也是ED发生的重要原因[17]。CaV1.3主要参与Ca2+浓度调节的第一个途径。平滑肌细胞中的肌浆网内存在CaV1.3，该通道与RyR1相似，可以通过调节细胞浆内Ca2+浓度，在兴奋-收缩偶联中发挥着非常重要的作用。

本研究发现，光镜下肝郁血虚ED模型大鼠阴茎平滑肌结构改变不明显，说明肝郁血虚ED的发生主要是平滑肌功能的异常，其形态结构尚未受影响。研究结果显示疏肝养血治法可有效恢复肝郁血虚ED模型大鼠的勃起功能；肝郁血虚ED模型大鼠阴茎平滑肌组织中CaV1.3与RyR1的蛋白表达降低，使平滑肌舒张功能产生障碍，影响到阴茎海绵体的充血，而疏肝养血治法可增高阴茎平滑肌组织中CaV1.3与RyR1的蛋白表达水平，可能与其能恢复肝之藏血，而肝主筋，肝血足可养宗筋，肝之疏泄有度，可调控平滑肌的收缩与舒张机能。基于“肝藏血，主疏泄”的理论，使筋为肝主，气血畅行，从而改善阴茎的血液循环，提高阴茎海绵体平滑肌充血灌注功能，以恢复阴茎之作强功能，从而达到治疗ED的目的。

综上，本实验结果认为阴茎平滑肌功能改变可能是肝郁血虚ED发生的病理基础之一，“肝藏”理论指导下的疏肝养血治法可改善阴茎的血液循环，从而达到治疗ED的目的。为临床“从肝论治ED”的物质基础与效应机制提供依据。

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（2016-05-27收稿）

The effects of "dispersing liver and nourishing blood" on the expression of CaV1.3 and RyR1 in corpora cavernosa tissue*

Zhang Peihai1, Huang Xiaopeng1,3, Cai Jian1, Yin Jing2, Li Guangsen1, Yu Xujun4, Chang Degui4, Chen Di'ang3**
1
. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Aff i liated Hospital, Chengdu 610075, China; 2. Sichuan Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Hospital; 3.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; 4.Second Aff i liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Corresponding author: Chen Di'ang, E-mail: 382455945@qq.com

Objective To investigate the material basis and effective mechanisms “Dispersing liver and Nourishing blood” regulates the corpus cavernosum smooth muscle based on the guidance of theory "Liver Storing".Methods Thirty SD rats were randomly divided into three groups: blank group, model group, treatment group, 10 rats in each group. The treatment group was treated with Siwu Decoction with Xiaoyao Powder. Blank group, model group given equal volume of saline continuous treatment for 14 days. During the experiment, the sexual activity of the rats, the smooth muscle morphology of the corpus cavernosum and the expression of CaV1.3 and RyR1 were observed.Results 1. Compared with that in blank group, the rats in model group had lower sexual activity with longer cross-latency[158.16±27.42s] and intromission latency[525.23±105.56s], lower frequency of straddling[35.31±6.17] and insertions [8.84±1.48] (P<0.05).Compared with those of the model group, across latency [49.62±18.65], insert latency [310.27±104.24], straddling times [96.07±18.26] and the number of insertions [15.21±4.63] of rats in the treatment group were signi fi cantly improved (P<0.05). 2. No obvious changes in morphology of corpora cavernosa tissue were found (P>0.05). Compared with that of the control group, the expressions of CaV1.3 [22059.51±10945.64] and RyR1 protein [25053.70±2941.02] in rat corpus cavernosum smooth muscle was signi fi cantly downregulated in the model group (P<0.05); Compared with that of the model group, the expressions of CaV1.3 [42386.31±9515.26] and RyR1 protein [38038.25±4980.82] was significantly upregulated in the treatment group (P <0.05).Conclusion "Dispersing liver and Nourishing blood" could signi fi cantly increase the expressions of CaV1.3 and RyR1 and promote Ca2+out fl owing, ultimately result in relax the penile smooth muscle, which may be one of material basis of theory "Liver Storing".

blood stored in liver; soothing liver; blood-de fi ciency; penis

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.004

R 698.1

资助：四川省教育厅“肝藏”调控阴茎勃起的物质基础与效应机制研究（项目批准号：12ZA033）**

，E-mail: 382455945@qq.com