高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中叶黄素含量的探讨

文/高 杨 尚东洋

（黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司）

高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中叶黄素含量的探讨

文/高 杨1尚东洋2

（黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司）

提出并建立了一种快速测定婴幼儿配方奶粉中叶黄素含量的高效液相色谱法。样品处理后，经C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱分离，甲醇作为流动相，高效液相-紫外检测器检测，外标法进行定量。试验结果表明，C18色谱柱检测叶黄素保留时间稳定，分离效果良好，且峰型良好，能够满足检测要求。该方法具有操作简单、快速准确、节省试剂、污染少等特点，具有较好的实用性。

叶黄素；高效液相色谱法；婴幼儿配方奶粉

叶黄素系统名称为3，3，-α，β-二羟基-胡萝卜素，分子式为C40H56O2，相对分子质量为568.88（按2007年国际相对原子质量）。属于类胡萝卜素类色素，又名“植物黄体素”，是一种天然色素。叶黄素广泛存在于自然界的植物体中，其中万寿菊中含量最多。

叶黄素具有多种生物活性，富有营养而无副作用，因此用途非常广泛，可应用于食品、化妆品、医药、烟草和禽类饲料等领域。大量医学证据表明，叶黄素对视觉有保护作用，能够预防白内障、动脉硬化，并且有抗氧化、增强免疫力等功效，特别在预防癌变发生、延缓癌症发展等方面发挥了重要作用，是目前国际上功能性食品成分研究中的热点之一，具有广阔的开发前景。

鉴于叶黄素独特的生理功能，近年来，越来越多的乳品企业开展了将叶黄素添加到婴幼儿配方奶粉中的相关研究工作，并取得了一定的成效。随着添加叶黄素的婴幼儿配方奶粉陆续上市，准确、快速检测产品中叶黄素的含量对婴幼儿配方奶粉的质量控制具有重要意义。

目前，关于叶黄素含量的检测方法主要有纸层析法、薄层层析法、柱层析法、分光光度法、高效液相色谱法、液质联用法等。其中，高效液相色谱法普及率高、分析速度快、准确性高，是目前应用最为广泛，同时也是叶黄素含量测定最适用的检测方法之一。

2016年8月31日，国家卫生和计划生育委员会发布了GB 5009.248-2016《食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定》，该标准代替了GB/T 23209-2008《奶粉中叶黄素的测定 液相色谱-紫外检测法》。新发布的国标和旧国标相比，增加了对叶黄素标准溶液浓度的校正要求、操作过程注意点，更改了提取溶剂等，方法更加严谨，提高了回收率，测定结果准确稳定，可以很好地控制产品质量。但该方法操作步骤较为繁琐费时。笔者采用高效液相色谱-紫外检测器，以甲醇作为流动相，采用最普遍使用的C18色谱柱进行分离，操作简单、快速准确、节省试剂、减少污染、实用性强，可适用于婴幼儿配方奶粉中叶黄素含量的快速测定。

1 仪器设备与试验方法

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 主要仪器设备

高效液相色谱仪（日本岛津，型号为LC-20AT，配有紫外检测器）；涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号为XW-80A）；分析天平（美国奥豪斯，型号为CAV214C，感量0.1 mg）；数控超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司，型号为KQ-700DE）；紫外可见分光光度计（日本岛津，型号为UV2550）；氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，型号为WTN-2800D）；超纯水仪（沃特尔，型号为WP-UPLH-20）；冷冻速离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司，型号为TGL16M）；深冷冰柜（海尔医疗，型号为DW86L338）；移液器（DRAGON，1～5 mL）。

1.1.2 试剂材料

叶黄素标准品，Sigma，纯度≥98.0%；正己烷，色谱纯；无水乙醇，色谱纯；甲醇，色谱纯；二氯甲烷，色谱纯；0.45 μm滤膜，有机系；试验用水为实验室自己制备。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

准确称取2.00 g（精确至0.01 g）均匀试样于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL约50 ℃的温水，超声20 min，使样品充分溶解。

用移液管准确移取处理好的均匀样液1 mL于10 mL螺口试管中，加入1 mL无水乙醇，涡旋振荡1 min混匀，再加入3 mL正己烷，避光涡旋振荡提取3 min，4 500 r/min离心3 min，重复提取2 次，合并提取液，以10 mL水洗涤，4 500 r/min离心3 min分层，重复洗涤1 次，合并有机相，于室温氮气吹干，以甲醇涡旋振荡溶解残渣并定容至2 mL。冷冻30 min，4 500 r/min离心3 min，取上清液过0.45 μm滤膜，供液相色谱测定。

1.2.2 液相条件

色谱柱：C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；

流动相：甲醇；

流速：1.0 mL/min；

检测波长：445 nm；

进样体积：10 μL；

柱温：30 ℃。

2 试验结果与注意事项

2.1 标准曲线

2.1.1 标准溶液配制

标准储备溶液（200 mg/L）：称取标样0.001 g，用二氯甲烷溶解并定容至5 mL容量瓶，在-80 ℃冰箱中避光保存。

标准中间溶液（8 mg/L）：吸取1 mL储备液，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，在-80 ℃冰箱中避光保存。

标准工作溶液：根据灵敏度和使用需要，用甲醇稀释成标准工作溶液，浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L。此标准工作溶液需于分析前临时配制。

2.1.2 标准曲线及相关系数

用叶黄素标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。在0.10～0.50 mg/L范围内，叶黄素线性范围良好，线性回归方程为Y=29330X+2993.6，相关系数为0.9989。测试溶液中被测组分浓度在标准曲线的线性范围内。

2.2 加标回收率和相对标准偏差

在不含叶黄素的空白样品中，分别添加3 个不同梯度的叶黄素标准工作液，每个梯度做6 个平行样，按照1.2的样品处理方法进行处理。结果见表1：加标量为0.10～0.50 μg，其回收率为86.4%～95.3%，相对标准偏差为1.20%～3.83%。

2.3 注意事项

2.3.1 由于叶黄素稳定性差，对光敏感，所有试验操作应在500 nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行。

2.3.2 标准溶液配制后需要用紫外可见分光光度计校准，得到准确浓度。

图1 叶黄素标准曲线

表1 平均回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论

本文以GB 5009.248-2016《食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定》为基础，对方法进行了改进，方法改进后具有操作简单、快速准确、节省试剂、污染少等特点，具有较好的实用性。C

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高杨（1987-），女，助理工程师，从事乳品质量管理工作。

2017-04-19）