沙冬青C2H2型锌指蛋白基因AmZFP1的克隆与表达分析

任美艳，王志林，郭慧琴,薛 敏，殷玉梅，王茅雁

(内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

沙冬青C2H2型锌指蛋白基因AmZFP1的克隆与表达分析

任美艳，王志林，郭慧琴,薛 敏，殷玉梅，王茅雁

(内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

为了研究强抗逆植物沙冬青寒旱诱导表达基因AmZFP1(Zinc finger protein 1)的生理功能，通过转录谱分析，从中鉴定出一个受寒旱诱导的ZFP全长cDNA序列并命名为AmZFP1。利用半定量RT-PCR方法对AmZFP1进行了表达分析，结果表明，在室内正常培养的沙冬青幼苗中该基因有较高表达量，在低温或干燥处理2～48 h其表达量明显上调，尤其以干燥处理上调速度更快且上调幅度略高；在野外自然生长植株的嫩叶、花蕾和幼嫩果荚中AmZFP1均有较明显的表达，而在嫩枝和根中检测不到其转录本；在野外植株的嫩叶中，AmZFP1在严冬季节高表达，而在春、夏、秋温热季节表达水平低或很微弱。利用RT-PCR方法克隆到AmZFP1编码区cDNA(816 bp)，推测其编码蛋白含有2个典型C2H2型锌指结构域及一个核定位信号。此外成功将该cDNA片段构建到植物表达载体p3300-353T上，为下一步深入开展该基因功能研究奠定了基础。

沙冬青；锌指蛋白；表达分析；基因克隆

植物在自然条件下生长，经常会遭受低温和干旱等非生物逆境的危害，从而严重影响其生长发育和产量。为了适应这些逆境，植物通常会改变自身的生理生化反应和基因表达水平甚至形态结构，以形成各种抗逆机制来减轻逆境造成的伤害[1-2]。大量研究表明，植物对各种逆境的响应均由相应的信号转导途径来调控，其中转录因子是这些信号途径中的重要成员，它们通过调节许多抗逆功能基因甚至调节基因的表达而在植物抵抗逆境的分子机制中扮演重要角色[3]。因此，克隆更多具有抗逆功能的转录因子基因一直是植物科学领域的研究热点之一。

锌指蛋白(Zinc finger proteins，ZFPs)是植物中广泛存在的一类转录因子，其典型特征是具有由Zn2+和半胱氨酸(Cys/C)和/或组氨酸(His/H)残基形成的一种稳定的“手指状”结构，即锌指，其中Zn2+是锌指结构的核心。这类转录因子可通过锌指结构与特定的DNA或RNA序列结合，或者通过与其他蛋白质互作来调节靶基因的转录水平，进而影响植物的生长发育和胁迫响应过程[4-5]。ZFPs构成一个数目庞大的蛋白家族，每个成员中所含的锌指数目及其结构不尽相同。根据锌指中Cys和His的数目和位置不同，可将该家族分为C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2和C8等不同类型，其中以C2H2型数目最多且与植物抗逆性关系较为密切[6-7]。拟南芥SAT10/STZ是第一个被证明与非生物胁迫相关的C2H2型锌指蛋白转录因子。将STZ基因在钙调磷酸酶缺失的酵母突变体中进行超表达可消除其盐敏感表型，这可能与该基因能够上调突变体中耐盐相关基因的表达有关[8]。后人们陆续证明来自其他植物的多个ZFP基因也具有类似的耐逆调节功能。例如，将大豆C2H2型ZFP基因SCOF-1在拟南芥和烟草中过量表达可以提高这些植物的耐冷性[9]。也有一些ZFPs对植物耐逆性起负调节作用，在其编码蛋白的近C端常含有一个具有转录抑制活性的EAR(ERF-associated amphiphilic repression)结构域，可能通过抑制靶基因的转录活性而发挥功能[10]。拟南芥的AZF1(Arabidopsiszinc-finger protein 1)和AZF2即属于这类基因，它们可能通过下调渗透胁迫和ABA(Abscisic acid)信号途径的多个靶基因的表达水平而降低耐逆性[11]。可见ZFPs与植物耐逆性的关系较为复杂，克隆和鉴定更多的ZFPs对于深入了解该基因家族在植物抗逆性中的作用具有重要意义。

沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus，又称蒙古沙冬青)是内蒙古和宁夏等中国西北省区特有的唯一常绿阔叶灌木，也是我国重点保护的珍稀濒危植物。其分布地属于典型的寒旱荒漠区，因此，在进化中形成了极强的耐寒耐旱等耐逆特性[12-13]。近年来，从该植物克隆和鉴定耐逆基因的报道迅速增加，其中属于ZFP家族的基因有3个：AmZFPG可提高转基因烟草的耐寒、耐旱和耐盐性[14]；AmSTZF的转录受低温和干旱胁迫诱导[15]；Am6f3尚未进行功能验证[16]。笔者在前期利用Illumina技术对蒙古沙冬青进行了转录组测序和表达谱分析[17]，获得一个受寒旱诱导表达的ZFP全长cDNA序列，根据基因注释信息将其命名为AmZFP1。本研究分析了该基因在低温和干燥处理及野外自然条件下的转录变化及其在不同器官的转录水平，并对其编码区cDNA进行了克隆和植物表达载体构建，为后续深入研究其生理功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 样品采集

将蒙古沙冬青种子用次氯酸钠进行表面消毒，用沙培法培养成苗。将28 d龄幼苗在低温光照培养箱(BD-PRX-1000A)中进行低温处理(4 ℃，21 h；-2 ℃，8 h；-6 ℃，19 h)，分别在处理前(0 h)和处理后2，6，12，24，48 h将幼苗从土盆中取出，用预冷的自来水漂洗干净后取样。干燥处理是将幼苗从土盆中取出，用自来水漂洗干净后放于吸水纸上，在25 ℃进行自然干燥处理，取样时间点同低温处理。野外取样在2014年7月-2015年5月进行，取样地位于呼和浩特市蒙草抗旱公司植物园区。用于不同月份表达分析的嫩叶于每个月上旬取样。用于组织器官表达分析的花蕾于2016年4月15日取样，嫩叶、嫩枝、根和未成熟果荚于同年6月15日取样。将所有样品用锡箔纸包裹后在液氮中速冻，保存于-76 ℃。

1.2 总RNA提取和cDNA合成

将冻存样品用改进的TRIzol法提取总RNA[17]，然后用RNase-Free DNaseⅠ(TaKaRa公司)消化以去除残存的基因组DNA。取3.0 μg总RNA用M-MLV(Promega公司)逆转录酶合成cDNA第一链。

1.3 半定量RT-PCR分析

以蒙古沙冬青Amelf3作为内参基因，对不同样品的cDNA模板量进行均一化。用均一化的cDNA模板和AmZFP1表达引物(上游引物5′-CCTGACGGAGTTCTGGGAACC-3′；下游引物5′-TTCTGAACAGAGCTACATCGTTTCA-3′)进行PCR扩增。反应体系中含10×PCR缓冲液1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL，上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)，cDNA模板X μL，EasyTaq酶(5 U/μL)0.15 μL，用ddH2O补足至总体积15 μL。扩增程序为94 ℃预变性3 min；然后在94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 45 s进行35个循环；最后72 ℃ 7 min，4 ℃保存。将扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。试验重复3次。

1.4 基因克隆与蛋白预测

以低温处理样品cDNA作模板，用AmZFP1编码区引物进行PCR扩增。25 μL反应体系中含10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，上下游引物(上游5′-TTCTAGAAATTAATGGCTTTGGAGGCT-3′，加XbaⅠ酶切点；下游5′-AGGATCCAAATTTTCTGAACAGAGC-3′，加BamHⅠ酶切点)各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板1.0 μL，Primer starTaq酶(5 U/μL，TaKaRa公司)0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。扩增程序同1.3，但其循环数为32。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带(天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)并与pEASY-Blunt Cloning Vector(Trans公司)连接。将连接产物用热激法转化E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR检测获得阳性克隆并进行测序验证(北京华大基因公司)。用DNAMAN软件预测蛋白分子量和等电点；用Clustal X和GeneDoc程序进行蛋白多序列比对；用SoftBerry在线预测AmZFP1蛋白亚细胞定位。

1.5 植物表达载体构建

将AmZFP1克隆载体和植物表达载体p3300-35ST(pCAMBIA3300-35ST)转化的E.coli单克隆摇菌，用碱裂解法提取其质粒DNA。将质粒DNA用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ(TaKaRa公司)分别进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳和目的片段胶回收，然后用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收产物进行连接并转化E.coliDH5α感受态细胞，将单菌落进行PCR检测和质粒酶切鉴定，获得重组植物表达载体。

2 结果与分析

2.1 AmZFP1的表达分析

2.1.1AmZFP1的RNA-Seq表达谱 笔者在前期利用Illumina技术对蒙古沙冬青进行了转录组测序和表达谱分析[17]，获得一个受低温和干旱胁迫诱导的ZFP全长cDNA序列，根据基因注释信息将其命名为AmZFP1。RNA-Seq表达谱数据显示，在正常生长条件下(CK)AmZFP1在沙冬青幼苗中有少量表达，其RPKM(Reads per-kilobase per million reads)值为7.2；在低温处理2，8，24 h后其表达量持续上调，RPKM值分别为对照的3.8，8.7，11.4倍；在干燥处理3个时间点其表达量上调幅度更高，RPKM值分别为对照的9.9，23.2，13.6倍，其中以处理8 h后上调幅度最高(图1)。这些数据表明AmZFP1参与对低温和缺水或干旱胁迫的响应，也为我们选择该基因进一步开展其功能分析提供了依据。

CK.正常生长条件；C2、C8、C24和 D2、D8、D24.

2.1.2 室内胁迫条件下AmZFP1在沙冬青幼苗中的表达变化 为了进一步了解AmZFP1响应低温和干燥缺水的表达变化趋势，笔者利用半定量RT-PCR方法对AmZFP1在冷冻和自然干燥处理2～48 h的表达变化进行了检测。试验中首先利用DNase对提取的各份总RNA样品进行了反复纯化，以充分去除其中的基因组DNA残留。将纯化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳、分光光度法检测以及PCR扩增，结果表明其完整性和纯度均较高，可开展后续试验。将总RNA经逆转录合成cDNA第一链作模板，用内参基因Amelf3特异性引物进行PCR扩增，对各份样品的模板量进行均一化。然后用均一化的模板和AmZFP1特异性引物进行PCR扩增。结果表明，在处理前正常条件下(0 h)AmZFP1有较高水平的基础表达；在低温处理2，6，12，24 h后其表达量持续上调并在24 h达最高值，之后到处理48 h仍维持高水平表达；在干燥处理不同时间点其表达量也明显上调，但总体变化趋势与低温处理有所不同，即在处理2 h后其表达量即有明显提高，在处理6 h后略有降低，在处理12 h后又明显上调且达最高值并维持至24 h，至处理48 h后又可见有所回落(图2)。这一结果与图1所示RNA-Seq表达谱变化趋势基本一致，表明低温和干燥脱水均可诱导AmZFP1转录水平明显上调，但2种胁迫诱导该基因表达上调的时间进程或变化模式存在差异。

图2 沙冬青幼苗中AmZFP1在低温和干燥处理不同时间点的转录水平

2.1.3 野外自然条件下AmZFP1在不同器官和不同季节的表达模式 基因在野外自然条件下的表达变化更能反映其响应内外环境刺激的真实情况，为此首先利用半定量RT-PCR方法对AmZFP1在野外自然生长沙冬青成株不同器官中的转录水平进行了检测。为了降低环境影响，除花蕾外(取样稍早)其余样品均于同一时间取样。结果表明，AmZFP1在幼嫩果荚中表达量较高，在嫩叶中次之，在花蕾中也有少量表达，而在嫩枝和根中检测不到其转录本(图3)。由此推测AmZFP1可能与果荚的形成和叶片生长发育有关。

R.根；T.嫩枝；L.嫩叶；F.花蕾；P.幼嫩果荚。R.Roots；T.Twigs；L.Young leaves；F.Flower buds；P.Young pods.

以野外生长的沙冬青成株幼叶为材料，对不同季节AmZFP1的转录水平进行了半定量RT-PCR分析，为了解该基因受温度调节的表达变化模式。从图4可见，在7，9，10月上旬，AmZFP1的转录水平持续较低且在不同月份之间无明显差别，此期天气由炎热逐渐变得凉爽；在11，12和翌年1月上旬，AmZFP1的转录水平明显提高且达到最高水平，此期沙冬青取样地已进入深秋隆冬季节，夜间温度降至零下几度甚至零下二十几度；进入3，5月份后，随着温度回升其转录水平又明显降低甚至检测不到其转录本。这一结果表明，AmZFP1的转录水平与环境温度的变化密切相关，在深秋和隆冬时节其转录水平远高于其他季节，暗示其可能在沙冬青适应秋冬季严寒中发挥重要功能。

图4 AmZFP1在野外自然条件和不同月份的转录水平

2.2 AmZFP1编码蛋白基本结构特征分析

AmZFP1的完整编码区含816 bp，5′UTR和3′UTR分别为494，311 bp。推测其编码蛋白含271个氨基酸残基，分子质量为29.54 kDa，等电点为7.93。将AmZFP1蛋白与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、甜椒(Capsicumannuum)和大豆(Glycinemax)中已报道的6个C2H2型ZFPs进行多序列比对(图5)，其中ZFPs在NCBI中的接收号分别为：AtAZF2，GeneID:821495 ; AtZAT10,Gene ID: 839666; AtZAT6, GeneID:830313;CaZF, GeneID:101492310;CAZFP1,Gene ID:107867225;GmSCOF-1,GenBank:AAB39638.1。结果发现其与鹰嘴豆CaZF氨基酸序列的一致性最高(Identities=158/287=55%)，而与拟南芥AtAZF2一致性最低(Identities=111/298=37%)；在AmZFP1的中间区段含有2个典型的C2H2型锌指结构(CX2-4CX3PX5LX2HX3H)，其中有一段序列即QALGGH在这2个锌指结构中完全一致；在其第34-42位还有一个核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)KXKRSKR。此外，在其第53-62位有一个可能与蛋白质互作相关的保守富含亮氨酸(L)的L-box；在其靠近C端区域有一个与转录抑制相关的保守区域即DLN-box(又称EAR-box)。这些结构特征为C2H2型锌指蛋白所共有，表明AmZFP1属于该类型转录因子。利用SoftBerry软件对该蛋白的亚细胞分布进行预测，表明其定位于细胞核的可能性最大(分值为8.8)，进一步说明其可能作为转录因子而起作用。

2.3 AmZFP1编码区cDNA的克隆及其植物表达载体构建

为了通过转基因等技术鉴定AmZFP1的功能，以来源于沙冬青冬季嫩叶的cDNA作模板，对其编码区cDNA进行了PCR扩增，结果得到一条与预期大小相近的片段(图6)。将该片段与克隆载体连接后转化E.coli，然后进行菌落PCR检测获得了阳性克隆，将阳性克隆进行测序验证后进行植物表达载体构建等后续试验。

植物表达载体的构建用定向连接法。首先用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ将测序验证的AmZFP1克隆载体和植物表达载体p3300-35ST空载体分别进行双酶切、电泳分离和目的片段的回收，然后通过连接反应使AmZFP1编码区cDNA片段定向插入到p3300载体的35S启动子之后并转化E.coli。通过对转化产物进行菌落PCR检测和质粒酶切鉴定，均获得预期大小的目的片段(图7)，表明载体构建成功，将其命名为p3300-35S-AmZFP1。接下来可开展转基因植物的构建及其表型鉴定等后续工作。

▲.植物锌指结构中所特有的序列。▲.The special sequence of zinc finger motif in plant.

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR产物。M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR product.

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR产物；2.质粒酶切；A.AmZFP1植物表达载体菌落PCR鉴定图；B.重组表达载体p3300-35S-AmZFP1酶切鉴定图。

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR product；2.Restriction of the plasmid DNA；A.Confirmation ofAmZFP1 plant expression vector by colony PCR；B.Identification of recombinant expression vector p3300-35S-AmZFP1 by restriction endonucleases.

图7 AmZFP1植物表达载体菌落PCR和质粒酶切鉴定图谱

Fig.7 Confirmation of AmZFP1 plant expression vector by colony PCR and restriction analysis

3 讨论

据报道，目前与植物抗逆性关系较为密切的转录因子包括DREB(Dehydration-responsive element binding protein)、bZIP(basic domain leucine-zipper protein)、NAC(NAM、ATAF和CUC)、MYB(Myeloblastosis oncogene)、bHLH(basic helix-loop-helix)和ZFP等家族[18-19]。相对于DREB、bZIP和NAC等转录因子家族，迄今为止从ZFP家族中克隆的抗逆基因较少。植物中的ZFPs属于一个大家族，又可以分成多种类型，其中以C2H2型数目最多(拟南芥基因组中其编码基因有176个)、功能也较复杂[5]。综合已有资料，可知具有单锌指结构的C2H2型ZFPs可能与植物的生长发育关系较为密切，如拟南芥的SUPERMAN和AtZFP1分别参与花和叶的发育[4]；而与环境胁迫相关的ZFPs通常均含有2个典型的C2H2型锌指结构，如矮牵牛ZPT2-3的编码蛋白中含有2个典型的C2H2型锌指结构，其表达受低温、干旱和重金属等逆境胁迫的诱导，将该基因在矮牵牛中超表达可提高对水分胁迫的耐性[20]。水稻OsZFP182和番茄SiCZFP1的编码蛋白中也含有2个典型的C2H2锌指结构，二者的转录水平在低温和干旱等非生物胁迫下均明显上调，将这2个基因在拟南芥、烟草或水稻中超表达能够增强转基因植株对高盐或低温的抵抗能力[21-22]。不同植物种类相比，目前已鉴定的抗逆相关ZFP基因多数克隆自拟南芥等草本植物，而从木本植物中克隆得到的很少。

蒙古沙冬青属于豆科灌木类强抗逆植物，目前已克隆的ZFP基因有AmZFPG、AmSTZF和Am6f3，它们分别属于GATA和AN1型[14-16]。其中AmZFPG与转基因植物的耐寒、耐旱和耐盐性密切相关[14]，AmSTZF受低温和干旱胁迫的诱导[15]，而Am6f3与抗逆性的关系尚未见报道。笔者在前期研究中发现蒙古沙冬青转录组中至少有156个C2H2型ZFP Unigene序列，其中多个序列根据RNA-Seq表达谱数据受低温和干旱胁迫的显著诱导。本研究从中选择一个典型的C2H2型ZFP，即AmZFP1进行了表达分析并克隆到其编码区cDNA。序列分析表明在AmZFP1蛋白分子中除含有2个典型的C2H2锌指结构外还含有一个核定位信号和其他保守序列。RNA-Seq表达谱数据和半定量RT-PCR分析结果均证明在沙冬青幼苗中AmZFP1的表达受低温和干旱胁迫的诱导。而当进入春季气温回升后其转录水平又明显下降甚至检测不到其转录本。尽管光周期和土壤及大气湿度等因素可能会影响野外条件下AmZFP1的转录水平，但在本研究检测的8个月份中温度应该是变化最大的环境因素(采样时当地昼夜温度在7月上旬至10月上旬为17/25 ℃～17/9 ℃，11月上旬至1月上旬为4/-2 ℃～-1/-10 ℃，3月上旬至5月上旬为9/3 ℃～23/19 ℃)。故此，综合室内外表达分析结果，笔者认为AmZFP1参与对低温和干旱胁迫的响应，并可能在沙冬青抵抗逆境胁迫中起重要调节作用。此外，本研究还发现该基因在沙冬青的花蕾(4月份采样)和嫩叶及幼嫩果荚(6月份采样)中均有表达，而在嫩根和嫩枝(6月份采样)中几乎检测不到其转录本，暗示其也可能参与叶片、花和果荚的发育过程。本研究已克隆该基因并成功构建其植物表达载体，为进一步通过转基因等技术验证与鉴定其生理功能奠定了基础。

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Cloning and Expression Analysis ofAmZFP1，A C2H2-type ZFP Gene fromAmmopiptanthusmongolicus

REN Meiyan，WANG Zhilin，GUO Huiqin,XUE Min，YIN Yumei，WANG Maoyan

(College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China)

To investigate the physiological function of a cold-and drought-inducible geneAmZFP1 (Zinc finger protein 1) fromAmmopiptanthusmongolicuswith strong stress tolerance,the expression analysis ofAmZFP1 was performed by using the semi-quantitative RT-PCR method.The results showed that in the seedlings cultivated in normal growth conditions，a relatively high expression level ofAmZFP1 was detected.After exposing the seedlings to low temperature or dehydration treatment between 2 to 48 hours，the expression level ofAmZFP1 increased markedly，and this up-regulation was more rapid and slightly higher during the dehydration treatment.In the young leaves，flower buds and immature pods of theA.mongolicusplants grown in the wild，the expression levels ofAmZFP1 were quite high，whereas in the twigs and roots，the transcripts ofAmZFP1 were not detected.In young leaves of the wild grownA.mongolicusplants，the expression level ofAmZFP1 was obviously high in the cold winter but was low or quite weak in the warm or hot seasons，including spring，summer and autumn.Moreover，the coding region cDNA ofAmZFP1 was cloned by RT-PCR，whose predicted polypeptide contains two typical C2H2 type zinc finger domains and one nuclear localization signal.The cDNA fragment was also successfully inserted into the plant expression vector p3300-35ST.This work laid a foundation for further functional analysis ofAmZFP1.

Ammopiptanthusmongloicus；ZFPs；Expression analysis；Gene cloning

2016-11-12

内蒙古自然科学基金重大项目(2012ZD02)；内蒙古自然科学基金面上项目(2014MS0326)；国家自然科学基金项目(30960158)

任美艳(1990-)，女，山西朔州人，在读博士，主要从事植物抗逆分子生物学研究。

王茅雁(1961-),女，内蒙古准格尔旗人，教授，博士，博士生导师，主要从事植物抗逆分子生物学研究。

Q78

A

1000-7091(2017)02-0008-06

10.7668/hbnxb.2017.02.002