籽粒苋C4关键酶丙酮酸磷酸双激酶基因的原核表达及酶活性测定

贺飞燕，闫建俊，白云凤，冯瑞云，张维锋

(1.山西大学 生物工程学院，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院 作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031)

籽粒苋C4关键酶丙酮酸磷酸双激酶基因的原核表达及酶活性测定

贺飞燕1，闫建俊2，白云凤2，冯瑞云2，张维锋2

(1.山西大学 生物工程学院，山西 太原 030006；2.山西省农业科学院 作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西 太原 030031)

为了进一步探究籽粒苋丙酮酸磷酸双激酶(AhPPDK)蛋白的作用机制，构建了AhPPDK基因的原核表达载体，通过碱裂解提取质粒，经限制性内切酶酶切，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，选择正确表达的阳性重组子，将测序正确的重组质粒pEASY-E1-AhPPDK转化菌株Transetta(DE3)；利用IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明，重组AhPPDK能在大肠杆菌Transset(DE3)中高效表达，表达的重组蛋白质分子量约为108 kDa，与预期分子量相符，且为可溶性蛋白。利用紫外分光光度法测量结果表明，原核表达的AhPPDK具有酶活性，且上清粗酶液活性高于沉淀粗酶液。研究结果可为进一步探明AhPPDK蛋白的作用机制和转基因利用奠定基础。

籽粒苋；AhPPDK；原核表达；酶活测定

在细菌、原生动物和植物中均存在丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate phosphate dikinase，PPDK)，该酶催化“丙酮酸+ATP+Pi↔磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)+ AMP+PPi+2H+”可逆反应[1]。在细菌和原生动物中，PPDK主要起丙酮酸激酶的作用，催化PEP生成ATP和丙酮酸。在植物中，受基质中高活性的焦磷酸酶和基质本身pH值等生理条件的影响，PPDK催化主要向生成PEP的方向进行。

植物PPDK可分为叶绿体PPDK(chPPDK)和胞质型PPDK(cyPPDK)。其中，chPPDK分布在细胞叶绿体中，分子量较大，N末端含有叶绿体转运肽，主要在C4植物的光合组织如叶片中大量表达，在其他部位如茎、花等组织中表达量很低[2-3]，也称之为C4型PPDK；cyPPDK主要分布在细胞质中，分子量较小，N末端不含叶绿体转运肽，主要在植物的非光合组织如根、种子及黄化叶片中表达[4-5]。有些植物，如玉米的PPDK基因具有双启动子转录系统，即同一个基因可通过2个启动子分别从2个不同的转录起始位点转录，从第1个外显子开始转录产生chPPDK，从第2个外显子开始转录产生 cyPPDK，第1个外显子编码叶绿体转运肽[6]。

PPDK是C4植物光合途径重要的限速酶，催化生成的PEP作为初始CO2受体，在 NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-malate dehydrogenase，NADP-MDH)的作用下进一步生成苹果酸。苹果酸进入维管束鞘细胞，在NADP-苹果酸酶(NADP-malate enzyme，NADP-ME)作用下释放的CO2被Rubisco固定进入三羧酸循环[7]，生成的丙酮酸进入叶肉细胞被PPDK重新利用。C3植物的PPDK表达水平低，参与了氮循环调控[8]、逆境胁迫应答等反应[4]，催化生成的PEP为氨基酸合成提供了碳骨架[9]。

将C4植物的PPDK基因在C3植物中过表达，以期提高C3植物的光合效率，成为作物遗传改良的热点之一。籽粒苋(A.hypochondriacus)又名千穗谷、西粘谷、苋菜等，为双子叶C4植物[10-16]，生长快、抗性强、光合效率高[17-18]。迄今为止，对于籽粒苋C4光合基因的研究、利用的报道甚少。

山西省农业科学院作物科学研究所植物转基因课题组已经克隆了籽粒苋PPDK(AhPPDK)基因(GenBank注册号：JF907701)，获得了原核重组蛋白，测定了酶活性，以期为进一步探明该蛋白的作用机制和转基因利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株和质粒 质粒PUC18-AhPPDK由山西省农业科学院作物科学研究所转基因实验室保存。原核表达载体pEASY-E1，Trans1-T1和Transetta(DE3)感受态细胞均为北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.2 主要试剂 本试验所用的LATaqDNA聚合酶、dNTP，限制性核酸内切酶XbaⅠ，PstⅠ，EcoR Ⅰ等购自TaKaRa(大连宝生物公司)。琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒购自北京艾德来生物科技有限公司。DNA Marker、Premixed Protein Marker、IPTG均购自TaKaRa公司，考马斯亮蓝G-250为北京康为世纪生物科技有限公司产品。氨苄青霉素购自Sigma公司。LB液体培养基、LB固体培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、PBS缓冲液、30%(m/V)Acrylamide、10%过硫酸铵、5×Tris-Glycine Buffer以及5×SDS-PAGE Loading Buffer等配制所需的药品和试剂购自国内外公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原核表达载体的构建及重组质粒的转化 以山西省农业科学院作物科学研究所植物转基因实验室保存的PUC18-AhPPDK为模板，对AhPPDK基因进行PCR扩增，上游引物为5′-ATGATGGCTTCAGCTTATAA-3′，下游引物为5′-CGGTAACCTCACACAGCAACTTGAGCAGC-3′。PCR反应条件为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，57 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将目的基因与pEASY-E1载体连接，转化Trans1-T1，挑单菌落过夜培养，通过碱裂解提取质粒，经限制性内切酶酶切，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，选择正确表达的阳性重组子，送至测序公司进行测序。

1.2.2AhPPDK基因的原核表达 将测序正确的重组质粒pEASY-E1-AhPPDK转化菌株Transetta(DE3)，37 ℃倒置过夜培养，在超净工作台上，用提前灭菌牙签挑取白色单菌落，并接种于5 mL含有氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基，在转速为200 r/min，37 ℃过夜摇菌活化培养；取活化菌液1 mL并在100 mL灭菌的LB液体培养基中(含Amp+)中继代培养(37 ℃，200 r/min)，振荡培养约3～4 h后，利用紫外分光光度计测定菌液浓度。当菌液浓度OD600值为0.4～0.6时，加入1 mmol/L的IPTG，37 ℃下分别诱导2，4，6 h。反应结束后，各取菌液2 mL，14 000 r/min离心1 min，收集菌体，用1 mL的PBS缓冲液悬浮菌体(pH值7.4)，25 μL体系中各取20 μL的菌液加入5 μL的5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5～10 min，14 000 r/min离心1 min，立刻冰浴5 min，取10 μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，用考马斯亮蓝G-250染色后，经过夜并用蒸馏水进行脱色3～4次来检测蛋白表达情况。

1.2.3 丙酮酸磷酸双激酶的酶活测定 在丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的催化下，PEP、AMP和焦磷酸可形成丙酮酸，丙酮酸在过量的乳酸脱氢酶作用下形成乳酸，同时可使还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化。根据340 nm下OD值的变化可计算NADH的量，由NADH的量即可推算出PPDK的酶活力[19]。

将原核表达的培养物离心收集菌体，用PBS悬浮洗涤，离心后重悬于PBS液(加入溶菌酶100 μg/mL，0.1%的Triton X-100)，室温消化30 min，-20 ℃冻融30 min，然后反复3次破碎细胞，再利用超声波破碎仪在功率为200 W的条件下，工作3 s，停5 s，20个循环，离心前的酶液即为全菌液，离心得到的上清即为上清粗酶液，沉淀用PBS悬浮即为沉淀粗酶液，4 ℃保存备用。按表1配制2 mL的反应体系，将配好的反应体系摇匀，置于比色杯中，以蒸馏水为空白对照，在340 nm测定OD值，作为零点值；再将0.067 mL 30 mmol/L焦磷酸钠加入比色杯内，反应立即开始，用计时器计时，每20 s测定一次OD值，并记录，以1 min内的光密度变化计算酶活力。

表1 AhPPDK酶活测定的反应体系

酶活力=(ΔOD×Vt)/(6.22×d×Δt×Vs)，式中：ΔOD表示反应最初1 min内340 nm处OD值变化的绝对值；6.22表示每毫摩尔NADH在340 nm处的光密度；d为比色杯光程(cm)，Δt表示测定时间为1 min；Vt为酶液总量(mL)；Vs为反应液体积(mL)；酶活力单位为μmol/(min·mL)。

2 结果与分析

2.1 基因克隆及原核表达载体构建

以克隆载体pUC-AhPPDK为模板进行PCR扩增，克隆AhPPDK基因，1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，可见大约3 kb的片段(图1)。将该片段回收，与pEASY-E1表达载体连接，构建形成重组质粒pEASY-E1-AhPPDK，对重组质粒进行PCR检测，用EcoRⅠ、XbaⅠ和SacⅠ分别单酶切检测(图2)，结果显示，经EcoRⅠ单酶切得到1 196，1 320 bp共2个片段，XbaⅠ单酶切得到909 bp，SacⅠ单酶切得到2 128 bp，与预期相符。选择正确表达的阳性重组子进行测序，结果表明(图3)，连入表达载体pEASY-E1中的基因序列与原载体上的AhPPDK序列一致。

在重组质粒pEASY-E1-AhPPDK上，AhPPDK序列上游为6-His序列标签(图3下划线所示)。测序结果表明，6-His-AhPPDK不会出现移码突变，表明pEASY-E1-AhPPDK原核表达载体构建正确，然后将其转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中，进行蛋白诱导。

M.DL5000 DNA Marker；1～3.PCR扩增产物。M.DL5000 DNA Marker；1-3.PCR amplification products.

M.DL5000 DNA Marker；1～3.EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Sac Ⅰ分别单酶切。M.DL5000 DNA Marker；1-3.The single cleavage map of EcoR Ⅰ,Xba Ⅰ,Sac Ⅰ.

2.2 原核表达和SDS-PAGE凝胶电泳

将重组质粒pEASY-E1-AhPPDK转入菌株Transetta(DE3)后，用1 mmol/L IPTG诱导剂分别诱导2，4，6 h，用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，结果表明，重组AhPPDK得到高效表达，蛋白分子量约为108 kDa(图4中右面箭头所示)，与预期相符。从电泳结果还可以看出，蛋白的表达量在6 h时达到最高。将诱导6 h的大肠杆菌的菌液超声波破碎后，经SDS-PAGE电泳检测上清和沉淀表明，目的蛋白主要在上清中表达，是可溶性蛋白(图5)。

图3 重组原核表达载体pEASY-E1-AhPPDK部分序列

M.蛋白Marker 44.3～200 kDa；1，2，3分别为AhPPDK基因经IPTG诱导6，4，2 h；4.AhPPDK基因未诱导。M.Protein Marker 44.3-200 kDa；1，2，3 were AhPPDK genes induced by 6，4，2 h，IPTG；4.AhPPDK gene was not induced.

2.3 丙酮酸磷酸双激酶的酶活测定

对诱导表达的大肠杆菌的菌液超声波破碎，收集上清和沉淀，采用分光光度法测定AhPPDK的活性，结果表明，该酶具有活性，全菌粗酶液的活性为0.5 μmol/(min·mL)，上清粗酶液的活性为0.4 μmol/(min·mL)，沉淀粗酶液的活性为0.08 μmol/(min·mL)，说明丙酮酸磷酸双激酶主要以可溶性形式存在(表2)。

M.蛋白Marker 44.3～200 kDa；1，2分别为pEASY-E1-AhPPDK诱导6 h的沉淀和上清的粗酶液。M.Protein Marker 44.3-200 kDa；1，2 were precipitated and supernatantof the crude enzyme solution of pEASY-E1-AhPPDK induced for 6 h.

表2 各样品中AhPPDK酶活力

Tab.2 The enzyme activity of AhPPDK in each sample

样品SampleAhPPDK酶活力/(μmol/(min·mL))AhPPDKenzymeactivity全菌粗酶液Totalbacterialcrudeenzymesolution0.50上清粗酶液Supernatantcrudeenzymesolution0.40沉淀粗酶液Precipitatedcrudeenzymesolution0.08

3 讨论

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是植物C4途径的关键酶之一，在植物光合作用中催化ATP和丙酮酸再生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。一些常见的主要农作物如水稻、小麦、马铃薯、甜菜等均为C3作物，光合效率不高是限制这些作物产量进一步提高的重要内在因素之一。通过基因工程技术，将PPDK基因从C4植物中克隆出来，然后导入C3植物，有可能提高C3植物的光合效率，从而提高作物产量。山西省农业科学院作物科学研究所植物转基因实验室先前克隆了籽粒苋C4型丙酮酸磷酸双激酶基因AhPPDK，本研究通过原核表达获得了AhPPDK蛋白，结果表明，该蛋白具有酶活性，为下一步转基因利用奠定了基础。

在原核表达系统中，目标蛋白以可溶性形式存在，可为后期功能验证等研究提供便利。原核表达的蛋白能否以可溶性形式进行表达，与原核表达质粒、大肠杆菌菌株、诱导剂浓度大小以及诱导时间和温度等多方面因素的影响有关。本试验结果发现，在诱导表达温度为37 ℃、诱导剂IPTG浓度控制在0.5 mmol/L、诱导时间为2～6 h时，有利于促进AhPPDK蛋白可溶性表达，且在6 h达到最高；另外，降低转速也可提高AhPPDK蛋白可溶性表达量。

不同生物对密码子的偏好性会影响蛋白质表达效率。山西省农业科学院作物科学研究所植物转基因课题组先前分析了AhPPDK的密码子偏好性，结果发现其与酵母菌的差异小于大肠杆菌[20]。但由于大肠杆菌表达所需时间较短、成本较为低廉，本研究先采用大肠杆菌系统表达出了AhPPDK蛋白，并探明其具有酶活性，下一步拟采用酵母系统表达AhPPDK，以进一步探明其作用机制。

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Prokaryotic Expression and Enzyme Activity Determination of C4Key Enzyme Pyruvate Phosphate Dikinase Gene inAmaranthhypochondriacus

HE Feiyan1，YAN Jianjun2，BAI Yunfeng2，FENG Ruiyun2，ZHANG Weifeng2

(1.College of Bioengineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute of Crop Science，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Shanxi Province Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement，Key Laboratory of Loess Plateau Crop Gene Resources and Germplasm Creation，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031，China)

To further explore the mechanism of action of AhPPDK protein，the prokaryotic expression vector ofAhPPDKgene was constructed.The plasmid was extracted by alkaline lysis，digested with restriction endonuclease，detected with 1.0% Agarose gel.The correct recombinant plasmid pEASY-E1-AhPPDKwas transformed intoE.coliTransset(DE3)，and the recombinant protein was induced by IPTG.SDS-PAGE analysis showed that recombinant AhPPDK could be highly expressed inE.coliTransset(DE3).The expressed recombinant protein had a molecular weight of 108 kDa，which was consistent with the expected molecular weight and was soluble protein.Pyruvate formed by pyruvate phosphodiesterase(PPDK)catalyzes the formation of lactate by excess lactate dehydrogenase and oxidizes reduced coenzyme I(NADH).Using ultraviolet spectrophotometry，the amount of NADH could be calculated according to the change of OD value at 340 nm，and then the activity of PPDK could be deduced.Spectrophotometric method showed that the prokaryotic expression of AhPPDK had the activity of enzyme.These results provide a basis for the further study on the mechanism of action of AhPPDK and the use of transgenes.

Amaranthhypochondriacus；AhPPDK；Prokaryotic expression；Enzyme activity determination

2017-02-03

国家自然科学基金项目(30971838)；山西省自然科学基金项目(201601D011075)

贺飞燕(1991-)，女，山西临汾人，在读硕士，主要从事植物分子育种研究。

白云凤(1957-)，女，山西吕梁人，研究员，博士，硕士生导师，主要从事植物分子遗传和改良研究。

S330；Q78

A

1000-7091(2017)02-0061-05

10.7668/hbnxb.2017.02.010