紫苏脂肪酸硫酯酶基因PfFatA生物信息学及其表达特性分析

李 璐，梁 倩，安 茜，周雅莉，王计平

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

紫苏脂肪酸硫酯酶基因PfFatA生物信息学及其表达特性分析

李 璐，梁 倩，安 茜，周雅莉，王计平

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

为研究脂肪酸硫酯酶A(FatA)在紫苏脂肪酸合成机制中发挥的作用，对紫苏FatA基因及其编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果表明，PfFatA基因cDNA全长1 652 bp，开放阅读框1 119 bp，编码372个氨基酸；紫苏FatA基因编码的蛋白质为亲水性不稳定蛋白，无跨膜区域；含Acyl-ACP_TE保守结构域，属于Hotdog fold超蛋白家族；多序列比对结果发现，序列C端含有保守的三联肽AKL和SKV结构；系统进化树分析表明，紫苏与丹参亲缘关系较近。通过Real-time PCR分析得知，PfFatA在紫苏根、茎、叶、花和种子不同发育时期均有表达，其中，在种子发育初期表达量最高。该研究结果可为进一步阐明PfFatA基因的功能及作用机制奠定基础。

紫苏；脂肪酸硫酯酶基因(FatA)；生物信息学；表达分析

植物脂肪酸合成过程中，脂肪酸硫酯酶(Fatty acid thioesterase)是游离脂肪酸从头合成的关键酶，直接决定植物油的链长和脂肪酸种类[1]。根据其氨基酸序列的不同将植物中硫酯酶分为2类，分别为FatA和FatB[2]。其中，FatA对18∶1-ACP具有高活性，在植物中普遍存在且高度保守，有关拟南芥的研究结果表明，其基因组中含有2个FatA基因和一个FatB基因[3]。FatA基因有2个拷贝，分别为FatA1和FatA2，这2个硫酯酶亚基表达作用相似且几乎在所有组织中都表达[4]，其中，FatA2在幼苗、根、叶、茎、花、果荚中都表达，尤其在果荚中表达量高；相反，FatA1基因在叶和嫩果荚中表达量很低，而在其他器官中很难被检测到，表明拟南芥中FatA2基因对种子脂类代谢和果荚发育起重要调控作用[5]。

紫苏(Perillafrutescens)是一种新型油料作物，种子含油量高达35%～46%，富含α-亚麻酸[6]，FatA基因是脂肪酸合成过程中的关键酶基因，该基因编码的蛋白质表达量的增加可促进不饱和脂肪酸含量的增加[7]，同时该蛋白的遗传多样性较低，不同植物中保守性较强[8]。

本试验为了进一步研究FatA基因在紫苏脂肪酸合成过程中的作用，对该基因进行了详细的生物信息学分析，并对其编码蛋白质进行了初步功能预测；通过Real-time PCR检测FatA基因在紫苏根、茎、叶、花和种子不同发育时期的表达量，以期为该基因在紫苏等油料作物中的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试植物材料为紫苏优选品种晋苏1号，种植于山西农业大学农作站试验田，在紫苏生长不同阶段分别取根、茎、叶、花和不同发育时期的种子(即开花后10，20，30，40 d的种子)，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 紫苏PfFatA基因鉴定 以紫苏转录组测序数据为依据，从中挑选出功能注释为FatA的基因，参照刘志勇等[9]的方法，根据不同物种间同源基因核酸序列相对保守的特点，将拟南芥FatA与紫苏中该基因同源序列进行比对分析，最后得到紫苏PfFatA基因cDNA序列。

1.2.2 紫苏PfFatA基因编码蛋白的生物信息学分析 借助在线分析软件ProtParam(http://web.expasy.org /protparam/)对紫苏FatA基因编码蛋白进行理化性质分析；利用TMPred(http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_ form.html)软件和 ProtScale工具(http：//web.expasy.org)分析紫苏FatA的跨膜区域及疏水区域；通过NCBI的CDD(Conserved domain database)数据库对其功能结构域进行分析鉴定；登陆在线软件SOPMA对紫苏FatA二级结构进行预测。采用在线分析软件Swiss-model(http://www.swissmodel.expasy.org/)进行紫苏FatA三级结构分析并进行建模。运用MEGA 6.0多序列比对软件对紫苏及近缘种的FatA进行比对，并构建系统进化树，分析其近缘物种间的同源性，获得相关的进化信息。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 利用TRIzol总RNA提取试剂盒提取紫苏根、茎、叶、花和不同发育时期种子的总RNA。选取18S rRNA作为内参基因[10]，以获得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购于TaKaRa有限公司，应用CFX96 Real-Time PCR Detection System进行扩增。反应体系为：SYBR Premix ExTaq Ⅱ12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL共25 μL；反应程序为95 ℃ 30 s，40个循环：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算[11]。

2 结果与分析

2.1 紫苏PfFatA基因全长cDNA序列及编码蛋白的生物信息学分析

通过对转录组测序结果比对分析获得PfFatA基因cDNA全长序列1 652 bp，ORF为1 119 bp(190～1 308)，共编码372个氨基酸(图1)，正电荷氨基酸残基数为49，负电荷残基数为46，理论pI为8.35，该蛋白呈碱性，相对分子质量为41.568 1 kDa，分子式为C1813H1899N535O556S15，共有5 815个原子，总平均亲水指数为-0.440，脂质指数为81.80，不稳定系数为44.78。因此，该蛋白质为不稳定蛋白。

氨基酸序列的疏水性决定蛋白质结构类型和稳定性。膜蛋白穿过膜的磷脂双分子层，这种特殊的环境决定了跨膜区必须由强疏水的氨基酸组成[12]。对紫苏FatA基因编码蛋白进行跨膜区域和疏水性分析可知，紫苏FatA基因编码蛋白为膜内蛋白，不存在跨膜区域(图2)，蛋白疏水指数为-2.95～1.75，为亲水性蛋白(图3)，预测结果与谭晓风等[13]对油茶FatA基因编码蛋白的分析结果一致。

利用NCBI-CDD对其蛋白序列进行保守结构域分析得知，该蛋白具有Acyl-ACP_TE结构域，属于Hotdog fold超蛋白家族。 利用SOPMA对该蛋白质二级结构进行预测，结果表明，该蛋白主要含无规则卷曲(38.17%)、α螺旋(34.95%)和β折叠(19.89%)3种结构元件，通过Swiss-model软件用同源建模的方法对紫苏FatA基因编码蛋白三维结构进行预测，结果如图4所示。

利用MEGA 6.0多序列比对软件对紫苏(Perillafrutescens)及其拟南芥(Arabidopsisthaliana)、可可(Theobromacacao)、甘草(Erythrantheguttata)、芝麻(Sesamumindicum)和丹参(Salviamiltiorrhiza)等FatA基因编码蛋白序列进行比对分析，并构建进化树，多序列比对可知，该序列C端含有保守的三联肽AKL和SKV结构(图5)，属于过氧化物酶体功能蛋白[14]；FatA基因进化树分析结果显示，紫苏与丹参亲缘关系最近，与油料作物蓖麻亲缘关系较远(图6)。

图1 PfFatA基因的全长序列以及翻译出的氨基酸序列

2.2 实时荧光定量PCR分析

荧光定量PCR结果分析表明，紫苏PfFatA基因在根、茎、叶、花和不同发育时期的种子中均有表达(图7)，其中，种子发育初期(开花后10 d)表达量最高，为根系中该基因表达量的6.8倍；其次是叶片，为根系表达量的5.9倍；开花后30 d的种子中FatA基因表达量最低。说明PfFatA基因在种子脂类代谢和种子发育过程中起重要调控作用。

图2 PfFatA蛋白跨膜区预测

图3 PfFatA蛋白疏水性预测

图4 PfFatA蛋白三级结构预测

图5 FatA多序列比对

图6 FatA蛋白系统进化树

不同小写字母表示在0.05水平上方差分析差异显著性。Different lowercase letters in table mean significant at significant α=0.05.

3 结论与讨论

紫苏作为一种新型油料作物，其高产、优质的关键性是含油量及α-亚麻酸含量较高，紫苏油被医学界认为是深海鱼油的更新换代产品[15]。FatA作为脂肪酸合成的主要贡献者，大部分研究集中于该酶对种子形成过程中种子油积累所起的调控作用。本研究采用生物信息学技术对紫苏PfFatA基因编码的蛋白进行了分析，结果表明，PfFatA基因编码372个氨基酸残基，整条多肽链总体上表现为亲水性；其二级结构主要由α螺旋、无规则卷曲和β折叠组成。对其保守结构域分析得知，该蛋白具有Acyl-ACP_TE结构域，属于Hotdog fold超蛋白家族，FatA蛋白在紫苏不饱和脂肪酸合成过程中对18∶1-ACP具有高活性，在将新生成的脂酰-ACP 分解为 ACP和游离脂肪酸的过程中起重要作用[16]。系统进化树分析显示，不同植物FatA基因编码的蛋白具有较高的相似性，从进化上来看，紫苏与丹参的亲缘关系最近，FatA基因所编码蛋白质的残基序列相似性达到85.2%，说明紫苏既可作为油料作物，又可作为中药材[17]；同时也反映了同源蛋白在不同物种中功能的相似性。

关于FatA基因在不同植物不同组织中表达分析研究较多，模式植物拟南芥FatA双缺突变体的研究结果分析显示，FatA基因控制脂肪酸的合成与脂肪酸含量的高低[18]；李铁柱等[8]对杜仲α-亚麻酸生物合成相关基因表达的研究结果表明，FatA在幼果和成熟果实表达量无显著差异，说明FatA基因在其果实形成过程中虽一直表达，但保守性较强；对于油菜、花生的Fat蛋白结构域分析可知，该蛋白质主要功能是在脂肪酸合成过程中将酰基基团从酰基载体蛋白上解离下来，终止脂肪酸的延伸过程[19-20]。本试验通过实时荧光定量PCR技术研究PfFatA基因在紫苏不同组织和种子发育不同时期的表达，结果表明，该基因在不同组织器官中都有表达，但在种子发育初期表达量最高；其次是叶片，这一结果与Wang等[5]对拟南芥FatA基因的研究结果相似。

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Bioinformatics and Expression Characteristics Analysis of Fatty Acid Thioesterase Gene inPerillafrutescens

LI Lu，LIANG Qian，AN Xi，ZHOU Yali，WANG Jiping

(College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

In order to detect the function of fatty acid thioesterase (FatA) in fatty acid synthesis mechansim of perilla, many bioinformatics analytical methods were used to analyze the protein encoded by FatA gene.The result showed that full length of cDNA forPfFatAwas 1 652 bp，open reading frame(ORF)was 1 119 bp，coding 372 amino acids.FatA was an unstable hydrophilic protein，without transmembrane region.FatA protein contained a conserved domain of Acyl-ACP_TE，belonging to the Hotdog fold super protein family.Multiple sequence alignment indicated that FatA had highly conserved triple peptide of AKL,SKV in the C-terminal.Phylogenetic tree analysis showed thatPerillafrutescenshad the closest genetic relationship withSalviamiltiorrhiza.The result of Real-time PCR showedPfFatAwas expressed in roots，stems，leaves，flowers and seeds from different development period，especially in seeds formed in 10 days after flowering.These results of the current study provided a foundation for further illustrating the function and mechanism ofPfFatAgene.

Perillafrutescens；Fatty acid thioesterase；Bioinformatics；Expression analysis

2017-02-01

国家自然科学基金项目(31201266)

李 璐(1992-)，女，山西灵石人，在读硕士，主要从事紫苏油脂代谢机理研究。

王计平(1974-)，女，山西阳泉人， 副教授，博士，硕士生导师，主要从事植物油脂代谢机理研究。

S565.8；Q78

A

1000-7091(2017)02-0104-05

10.7668/hbnxb.2017.02.016