昆虫杆状病毒egt基因研究进展

王海萍，吴小锋

（浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058）

昆虫杆状病毒egt基因研究进展

王海萍，吴小锋＊

（浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058）

杆状病毒是一类大分子的双链环状DNA病毒，其编码的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（egt）在感染昆虫后表达产生EGT酶。EGT酶的催化使宿主体内的蜕皮激素失活，阻止幼虫蜕皮，从而利于病毒自身的繁殖。已有研究发现，敲除egt基因的杆状病毒感染的昆虫，死亡时间缩短，向上攀爬行为减弱。最近的研究还表明转egt基因的家蚕蚕蛹发育迟缓。从分子水平对EGT酶作用机制及其与宿主蛋白互作关系进行探索，将加深我们对杆状病毒调控宿主生长发育和行为变化策略的认识，有利于农业生产应用（特别是蚕丝业，如鲜茧缫丝），且为新型高效生物杀虫剂的研发提供新思路。

杆状病毒；egt基因；宿主昆虫；生长发育；行为

1引言

杆状病毒是一类具有双链、环状、超螺旋基因组的病毒，被包裹在杆状核衣壳中，也是已知昆虫病毒中的最大类群，宿主域仅限于无脊椎动物，特别是鳞翅目昆虫。杆状病毒分为α、β、γ和δ四个属，其中根据病毒表面囊膜蛋白GP64或F蛋白的差异，进一步将α属分为GroupⅠ和GroupⅡ两个不同的类别。杆状病毒的复制周期十分复杂，产生两种类型的病毒粒子：一种是包涵体衍生型病毒粒子（oc⁃clusion-derived virus，ODV），保证病毒在昆虫宿主体外的稳定及对中肠细胞的感染，引起病毒原发性感染周期；另一种是出芽型病毒粒子（budded virus，BV），在昆虫体内细胞与细胞之间传播，引起全身性感染［1］。

杆状病毒egt基因是非必需的早期基因，同时也是最早被发现的在个体水平调控感染宿主的基因。egt基因编码的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，EGT），能够催化葡萄糖基从UDP-葡萄糖转移到蜕皮激素上，使蜕皮激素失活，阻止幼虫的蜕皮，从而使幼虫继续摄食，导致昆虫体重增加，最终使病毒产量提高［2］。研究发现，从GroupⅡ型杆状病毒中敲除egt基因，会引起宿主昆虫攀爬行为减弱，表明杆状病毒可以通过EGT酶调控昆虫血淋巴中的蜕皮激素浓度，影响幼虫的运动行为［3］。也有研究报道，敲除egt基因的病毒感染能够加速宿主幼虫的死亡［4］，因此可以通过修饰egt基因位点提高杀虫速度。本文以杆状病毒模式种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovi⁃rus，AcMNPV）作为代表，对egt基因的基本性质及其对昆虫生长发育和运动行为的影响作一简要综述。

2 egt基因基本性质

egt基因位于AcMNPV基因组上第11426-12964 nt（ORF 15），编码506个氨基酸，预测分子质量57.01 kD。在所有鳞翅目昆虫的核型多角体病毒和大部分颗粒体病毒基因组中均发现egt的同源基因，但是在其它进化枝中没有发现。由于它在昆虫类固醇代谢中发挥作用，推测编码这种酶的基因来自于宿主。

egt基因具有两个鲜明的特征：一是该基因位于杆状病毒基因组中的一个缺失突变高发区，且可以转录成两个共5’末端的mRNA。这两种mRNA均不受蛋白合成抑制剂和DNA合成抑制剂的影响，表明egt基因的转录不依赖于病毒蛋白合成及病毒DNA复制，属于杆状病毒非必需的早期基因［5］；二是egt基因可以分泌表达，编码区5’端有信号肽序列，编码的EGT酶成为昆虫杆状病毒中第一个已知的分泌型蛋白（图1）。许多已测序的杆状病毒均含有egt基因，病毒侵染宿主时，EGT酶能在宿主细胞外聚集且稳定性强，所以不需连续表达合成，便能在整个周期内控制幼虫蜕皮与化蛹［6］。

图1 EGT的分子结构Figure 1 The molecular structure of EGT

3 egt基因对宿主生长发育的影响

3.1 egt基因与宿主昆虫蜕皮

蜕皮与变态是全变态昆虫典型的发育特征，以家蚕为例，其一生中要经过多次蜕皮，经历卵-幼虫-蛹-成虫（蛾）四个发育阶段，完成整个生命周期。控制昆虫蜕皮的激素主要是蜕皮激素，负责调控昆虫生长、变态和性成熟等多个相关基因的表达［7］。杆状病毒感染昆虫，通过egt基因的糖基化作用使蜕皮激素失活，干涉宿主的生长发育。

在体外试验中，AcMNPV的EGT催化UDP-半乳糖或UDP-葡萄糖基连接到蜕皮激素的22位碳原子（C22）的羟基上，形成蜕皮激素22-O-β-D吡喃葡萄糖苷，使其失活［2］。向四龄和五龄家蚕注射出芽型的野生AcMNPV，发现幼虫生长异常，其中部分家蚕龄期延长，另外一些家蚕龄期缺失直接过早化蛹，但最终两者均在蛹期死亡［8］。2006年Sakano等报道［6］，将非致病性的AcMNPV作为疫苗注射入蚕蛹中，使得其永久保持蚕蛹形态而不蜕变。以上研究表明，egt基因的表达会显著影响宿主的生长。

利用转基因技术，张星等［9］研究了转egt基因对家蚕发育的影响，通过精子介导法将含有家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，Bm⁃NPV）egt基因和荧光蛋白（gfp）基因的piggyBac转座载体整合入家蚕卵内，然后在G0代利用G418压力选择装置和GFP双重筛选，结合分子生物学方法，成功获得外源基因插入并稳定存在的雌雄转基因家蚕各一条。通过G0代的交配和G1代的杂交之后发现，egt基因的转座对家蚕的产卵率和孵化率产生了影响，G1代的产卵率和孵化率较正常的蚕种分别低25%和57.9%，表明蜕皮激素对蚕卵的产生和家蚕胚胎的发育是必需的。与非转基因家蚕相比，转基因家蚕G1代的幼虫期时间明显变长，G2代蛹期延长4 d，一些蚕蛹到蛾的变态发育甚至停滞。在三龄蜕皮阶段，G2代家蚕血淋巴中的蜕皮激素水平降低了90%，表明转基因家蚕的发育停滞可能是egt基因的表达引起蜕皮激素水平降低造成的。该研究表明，在蛹期利用特异性启动子控制egt基因的特异表达，可以延缓蚕蛹的发育，有利于鲜茧缫丝。

3.2 egt基因与生物杀虫活性

与传统化学杀虫剂相比，杆状病毒作为生物杀虫剂拥有宿主专一性和不污染环境的优点。但过高的宿主特异性和缓慢的发病致死作用两大缺陷，限制了杆状病毒作为农业杀虫剂的应用，因此昆虫病毒基因工程主要集中解决以上两个方面。egt基因作为病毒复制的一个非必需的早期表达基因，敲除后能够增强病毒毒力，加速害虫死亡和减少食物消耗。

早在上世纪90年代，O’Reilly和MⅡler通过生物测定发现，与野生型AcMNPV相比，缺失egt基因的AcMNPV感染的苜蓿尺蠖夜蛾死亡率提高［2］。之后20年间，研究者在不同的病毒上研究了egt基因突变体的功能。汤欣欣等［4］利用egt基因缺失型和蝎毒基因重组型的斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV）感染3龄斜纹夜蛾，发现与野生型病毒相比，两种重组病毒的LT50分别降低了25%和28%。Oihane Simón等［10］选用来自密苏里和尼加拉瓜的草地贪夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera frugiperda multipleNucleo⁃polyhedrovirus，SfMNPV）进行研究，发现egt基因的缺失或突变是导致杆状病毒产生快速杀虫现象的主要因素。

虽然有许多证据表明egt基因的缺失会加快昆虫的杀灭速度，但其缺失的影响是否取决于昆虫的幼虫阶段，并没有详细的研究。在Susumu Katsuma和Toru Shimada的研究中［11］，利用egt基因突变的BmNPV在家蚕4龄和5龄幼虫的连续10个时间段进行感染和生物学测定。结果表明，egt缺失导致的快速杀虫特性只有在幼虫-幼虫过渡的过程中进行病毒感染才有效，在幼虫-蛹的过渡时期，杀虫速度反而减慢。所有被缺失型病毒感染的4龄第2天的幼虫均进入蜕皮阶段并且比野生型病毒感染的幼虫死亡得更早。缺失型病毒感染的幼虫尸体内充满液体，推测是马氏管退化引起的。在4龄或5龄早期进行病毒感染的幼虫，两种病毒引起的死亡时间相差不大，但在5龄中期以后进行实验时，被egt基因缺失型病毒感染的幼虫存活时间却比野生型病毒感染的幼虫明显更长。这些结果表明，egt基因的缺失对杆状病毒杀虫速度的影响在很大程度上是依赖于宿主幼虫的发育阶段，这对于理解egt基因在杆状病毒对宿主昆虫调控中的作用以及egt基因位点的修饰在杆状病毒杀虫特性中的应用，都具有重要的意义。

4 egt基因影响宿主昆虫的运动行为

许多病毒和寄生虫都能够在感染昆虫后改变宿主的行为，例如蟋蟀受到线虫感染后，产生自杀行为；蟑螂被宝石黄蜂寄生后，出现长时间的运动行为减弱现象。普遍认为，寄生引起的宿主行为变化有利于病毒和寄生虫的再生、传播和存活。杆状病毒能够引起昆虫的行为改变，表现出多动症和“树高症”，爬高的昆虫被鸟类捕食之后会将病毒在更多的区域进行扩散，从而在更广的范围内传播病毒。

Hoover等的一项研究表明［3］，LdMNPV的egt基因可以引起舞毒夜蛾幼虫产生树高症。然而与Ld⁃MNPV不同，当敲除AcMNPV基因组中的egt基因，感染的幼虫仍然会在植物的顶端位置死亡，说明在AcMNPV中egt基因并不是诱导树高症产生的决定性因素［12］。

已经有许多关于树高症的研究，旨在解开杆状病毒诱导宿主行为变化的可能机制。Yue Han等人［13］对于egt基因在SeMNPV诱导昆虫树高症的过程中发挥的作用进行研究：将经过病毒感染的甜菜夜蛾幼虫单独放置在罐中，每天两次观察并记录幼虫垂直位置，直到其死亡。研究发现，野生型病毒感染的甜菜夜蛾幼虫在死亡之前爬高并最终在高处死亡，而被egt突变型的SeMNPV感染的幼虫却不会爬高。研究者推断，这种差异是因为被突变型病毒感染的幼虫较快死亡，因而并未来得及出现爬高行为，表明egt基因是通过延长幼虫的死亡时间促使树高症的发生。此外该研究也发现，敲除egt的开放阅读框或是其ATG起始密码子，都能阻止树高症的出现，说明EGT酶对于树高症这一行为现象是必需的。

5展望

目前，关于EGT如何阻断昆虫蜕皮激素的分子机制并不清楚，深入开展该方面的研究，不仅具有重要的科学理论意义，而且也具有重要的实际生产价值。例如，家蚕是一种重要的经济昆虫，为防止蚕蛹羽化破坏蚕茧，目前是利用高温烘茧的方式将蚕蛹杀死后进行缫丝，不仅成本高，而且质量无法与鲜蚕茧媲美。巧妙地控制EGT基因的表达，将有利于上述目标的实现。研究表明［9］，可以通过转egt基因的表达控制家蚕的发育和变态，阻止蚕蛹蜕变成蛾。此外，Gal4/UAS双元转基因系统已在2005年应用于家蚕中［14］，若将两者交叉构建一个完整的转基因体系，使蚕蛹处于停滞状态，可使鲜蚕茧缫丝成为可能。

迄今为止，对egt基因影响宿主幼虫杀死速度的研究结果并不一致，对于这种差异，我们分析主要有两个原因：一是幼虫龄期和感染时间的影响，二是试验中所用重组病毒的构建方式有差异。egt基因缺失型病毒基本可以分为两类，一种是突变体带有标记基因（如lacZ），另一种是仅带有缺陷egt的突变体。已有实验证明［15］，在杆状病毒基因组中通过插入lacZ破坏egt基因，会阻碍相邻基因的表达，对EGT的杀虫速度产生不确定影响。改善egt基因敲除型病毒的构建方法，在幼虫的不同龄期连续进行感染，并从分子水平阐明其杀虫效果作用机制，将为杆状病毒作为生物杀虫剂的应用提供新的参考。

关于杆状病毒感染晚期egt基因使宿主昆虫产生树高症的现象，我们认为今后该领域的研究工作应集中在两个方面。一是EGT酶在GroupⅠ和Ⅱ杆状病毒中作用的保守性有待研究，对此可以采用分子进化分析，并根据两种病毒类型基因组成上的差异展开研究。二是在能够诱导宿主产生树高症现象的LdMNPV和SeMNPV中，其操纵宿主行为的分子机制有待深入研究。新技术的交叉应用如转录组学、蛋白组学、神经生物学与基因组分析等相结合，将成为揭示病毒改变宿主行为机制的重要途径。

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The Research Progress of Baculovirus egt Gene

WANG Hai-Ping,WU Xiao-Feng＊
（College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Baculoviruses are characterized by a large circular double-stranded DNA genome,the ecdysteroid UDP-glucosyltransferase(EGT)was produced by egt gene after infecting insects.Catalytic activity of EGT can inactivate ecdysteroids,prevent the metamorphosis of larvae,thus contributing to the virus reproduction.Several lines of evidence have shown that the deletion of the egt from the nucleopolyhedrovirus genome shorten the dearth time and eliminate the upward climbing behavior of lepidopteran larval host.A recent study reported that egt expression in egt-transgenic silkworms results in arrest of metamorphosis from pupae to moths.Studies on the molecular mechanism of EGT and its interaction with host proteins will deepen our understanding of the effect of baculovirus on host growth and behavior changes.It is not only conducive to the production of agriculture(especially the silk industry,such as fresh cocoon reeling),but also provides new ideas for the research and development of new efficient biopesticides.

Baculovirus;egt gene;host insect;growth;behavior

Q786

A

0258-4069［2017］01-010-04

王海萍（1990-），女，山东烟台人，博士研究生，从事家蚕杆状病毒分子生物学研究。E-mail：1083196719@qq.com

吴小锋，男，教授、博士生导师。E-mail：wuxiaofeng@zju.edu.cn