NDM-1基因在不动杆菌属菌株中的分布调查*

牛冬梅 周万青 张之烽

NDM-1基因在不动杆菌属菌株中的分布调查*

牛冬梅 周万青 张之烽

目的 调查NDM-1基因在不动杆菌属菌株中的分布情况。方法 收集亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌25株、非鲍曼不动杆菌5株（分别为洛菲不动杆菌3株和琼氏不动杆菌2株）。采用改良Hodge试验及双纸片协同试验进行碳青霉烯酶表型筛选；PCR和DNA测序方法检测碳青霉烯酶基因；接合试验探讨耐药基因的可传递性；PFGE调查菌株的同源性。结果25株鲍曼不动杆菌改良Hodge试验阳性10株，金属酶表型试验均阴性，均检出OXA-23-like基因，未检出NDM-1基因；5株非鲍曼不动杆菌金属酶表型试验均阳性，均携带NDM-1基因，改良Hodge试验均阴性；PFGE显示鲍曼不动杆菌同源性较高，主要为A克隆株，而NDM-1阳性菌株不具同源性。NDM-1阳性菌株接合试验未获成功。结论 本院碳青霉烯类耐药不动杆菌属菌株中NDM-1基因分布在非鲍曼不动杆菌中，且为散发。

NDM-1 不动杆菌属 同源性

NDM-1（new delhi metallo-β-lactamase-1）是一种新型金属酶基因，可造成菌株对除氨曲南之外其他所有β-内酰胺类抗生素耐药。NDM-1基因一般存在于携带多种耐药基因的质粒上，从而造成菌株表现出多重耐药性。该基因主要在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中发现，另外在一些假单胞菌和不动杆菌属菌株中也有报道[1-3]。不动杆菌属作为机会致病性病原菌，是院内感染的重要病原菌，可造成肺炎、尿路感染、伤口感染、血流感染及心内膜炎等。目前碳青霉烯酶耐药的不动杆菌属菌株已呈世界范围播散[3]。现调查NDM-1基因在本院碳青霉烯耐药不动杆菌属菌株中的流行情况，并对相关耐药基因进行检测。

材料与方法

1 材料 收集2012年9月～2013年12月南京大学医学院附属鼓楼医院临床分离耐亚胺培南鲍曼不动杆菌25株、洛菲不动杆菌3株和琼氏不动杆菌2株。其中痰液18份、腹水4份、胆汁3份、导管头和尿液各2份、血液1份，无重复分离株。所有菌株均经API 32GN鉴定条（法国梅里埃公司）鉴定。以ATCC Escherichia coli 25922、ATCC Pseudomonas aeruginosa 27853、ATCC Klebsiella pneumoniae 1705、ATCC Klebsiella pneumoniae 1706为质控菌株；E. coli 600（利福平耐药）为接合试验的受体菌。

2 主要仪器及试剂 Taq DNA聚合酶、10×buffer（含Mg2+）、dNTPs（TaKaRa公司）；DNA Marker（北京全式金公司）；PFGE电泳琼脂糖（Bio-Rad公司），ApaⅠ内切酶（Fermentas公司），十二烷基肌氨酸钠、EDTA、Tris（上海生工公司）；蛋白酶K（Merck公司）；PCR扩增仪（PE公司）；CHEF Mapper XA 电泳仪及凝胶成像分析系统（Bio-Rad公司）；PCR引物由英俊公司合成。

3 药敏试验 药敏纸片购自英国Oxoid公司，多粘菌素B及替加环素MTS（MIC Test Strip，意大利Liofilchem公司）为辉瑞公司惠赠，亚胺培南E-Test为梅里埃公司产品。按照CLSI 2014版文件[4]，采用纸片扩散法检测受试菌对阿米卡星、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟、替卡西林/克拉维酸、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、米诺环素的耐药性；采用琼脂稀释法测定菌株对多粘菌素B的MIC；采用MTS测定菌株对替加环素的MIC；采用E-Test测定菌株对亚胺培南的MIC。判断标准参见CLSI 2014版。

4 碳青霉烯酶表型检测 EDTA纸片协同试验0.5麦氏单位待测菌均匀涂布MH平板，分别贴两张亚胺培南纸片，两纸片相距25 mm。在其中1张纸片上滴加500 mmol/L（pH 8.0）EDTA溶液5μl。35℃培养过夜，亚胺培南+EDTA纸片与单纯亚胺培南纸片的抑菌圈直径之差≥7 mm为金属酶阳性；改良Hodge试验（MHT）：按照CLSI 2009年版进行，以ATCC 1705作为阳性对照，ATCC 1706作为阴性对照。

5 细菌DNA的提取 挑取纯培养菌落置0.5 ml离心管内（内预置200 ng/ml蛋白酶K溶液200 μl），56℃水浴2 h，改95℃水浴10 min，13 000 g离心30 s。上清液即为基因检测的模板液，置-20℃冰箱备用。

6 P C R扩增和测序 采用P C R法扩增金属酶基因（M B L s），包括I M P、V I M、G I M、 S P M、S I M、N D M-1酶基因；O X A型碳青霉烯酶，包括O X A-2 3-l i k e、O X A-2 4-l i k e、OXA-51-like和OXA-58-like；KPC-2酶基因。参照文献[5-7]合成引物。其中N D M-1引物为两对，分别为NDM-1（1）：17U-191 5’-CAGCACACTTCCTATCTC-3’ 和17L-465 5’-CCGCCCTCCCCTCTT-3’；NDM-1（2）F-58 5’-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3’和R-344 5’-CGCAACACAGCCTGACTTTC-3’，产物分别为292 bp和287 bp。反应体系为50μl，其中10×buffer（含Mg2+）5 μl，dNTPs（各2.5 mmol/L）4 μl，DNA模板2μl，上下游引物（10 μml/L）各2μl，Taq DNA酶0.3 μl，ddH2O 34.7 μl，退火温度为55 ℃。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。阳性扩增产物送上海美吉公司进行双向测序，测序结果在GenBank上查询，并与BLAST比对。

7 接合试验 对数生长期的供体菌及受体菌（E. coli 600 R）各0.2 ml加入0.6 ml新鲜LB肉汤中，37℃过夜培养后，接种含亚胺培南（4 mg/L）+利福平（256 mg/L）的MH平板筛选接合子。供体菌和受体菌作为质控菌。

8 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型 将培养过夜的细菌用低熔点胶灌模，蛋白酶K消化2 h，限制性内切酶ApaⅠ（30 U）30 ℃酶切2 h。使用CHEF-Mapper XA型脉冲电泳仪，电压6 V/cm，夹角120☒，脉冲参数5～35 s，电泳19 h、温度14℃，分子量标记物为酵母染色体DNA。EB染色30 min，拍照。结果判定参照Tenover标准[8]。

结 果

1 药敏结果 30株不动杆菌属菌株对12种抗菌药物呈现出多重耐药。K-B纸片法结果显示，鲍曼不动杆菌对米诺环素、阿米卡星的敏感率分别为36%和32%，对其余10种抗菌药物耐药率为100%；5株非鲍曼不动杆菌对米诺环素、阿米卡星、复方新诺明敏感，对其余药物均耐药；所有检测菌株对多粘菌素敏感（MIC值均≤2μg/ ml），对亚胺培南全部耐药（MIC值均≥256μg/ ml）；5株非鲍曼不动杆菌对替加环素全部敏感（MIC值均≤2 g/ml）；25株鲍曼不动杆菌对替加环素敏感20株（80%），中介5株（20%）。

2 碳青霉烯酶表型筛选结果 25株鲍曼不动杆菌的MHT试验阳性10株，而EDTA协同试验均阴性；5株非鲍曼不动杆菌MHT试验均阴性，而EDTA协同试验均阳性，提示菌株携带金属酶。

3 耐药基因检测 25株鲍曼不动杆菌OXA-23-like和OXA-51-like基因全部阳性，未扩增出金属酶基因及OXA-24-like、OXA-58-like和KPC-2。5株非鲍曼不动杆菌所测耐药基因中仅NDM-1两对引物扩增结果为阳性，其余碳青霉烯酶基因均为阴性。NDM-1阳性产物在GenBank上比对结果显示与肺炎克雷伯杆菌（登录号JN677524.1）、阴沟肠杆菌（登录号JF798502.1）和鲍曼不动杆菌（登录号JF798501.1）的NDM-1基因同源性为100%。NDM-1 PCR结果电泳图谱及部分测序结果分别见图1、2。

4 PFGE图谱 25株鲍曼不动杆菌分为A（21株）、B（4株）两个克隆株，其中A克隆可分为A1、A2、A3和A4各8株、8株、4株和1株；而3株洛菲不动杆菌和2株琼氏不动杆菌PFGE图谱不具同源性，见图3。

5 接合试验结果 对NDM-1阳性菌株多次接合试验均未获成功。

图1 NDM-1 PCR结果电泳图谱

图2 NDM-1基因部分测序结果

讨 论

图3 非鲍曼不动杆菌PFGE电泳图谱

目前，鲍曼不动杆菌仍是院内感染的主要病原菌。其他少见细菌如琼氏不动杆菌、洛菲不动杆菌同样可造成免疫低下患者的院内感染，常见类型为导管相关性血流感染[9]。多重耐药不动杆菌除鲍曼不动杆菌外，多重耐药的洛菲不动杆菌及琼氏不动杆菌所引起的院内感染也屡有报道[10，11]。不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药机制较复杂，包括产碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失、外排泵的激活、青霉素结合蛋白的改变，其中产碳青霉烯酶最重要[12]。常见的碳青霉烯酶主要为两类：一类为金属酶（MBLs），如IMP、VIM、SPM、SIM、 GIM、NDM；另一类为D类的OXA型酶，主要为OXA-23、24、51和58。NDM-1作为一种新型金属酶，对除氨曲南之外的所有β-内酰胺类抗生素耐药，包括碳青霉烯类。该酶最初在1例印度裔瑞典尿路感染患者中发现，而后在全球范围均有报道。该类菌株除对所有β-内酰胺类耐药外，对喹诺酮类、氨基糖苷类也可耐药，仅对替加环素和黏菌素保持一定敏感性[2]。

本调查显示，临床分离亚胺培南耐药不动杆菌属菌株对多种药物呈现出耐药性。通过表型筛选试验提示5株非鲍曼不动杆菌菌株表达B型碳青霉烯酶，PCR及测序结果证实为NDM-1型金属酶，而25株鲍曼不动杆菌主要携带OXA-23-like基因。NDM-1阳性菌株同时对喹诺酮类耐药，而对氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、多粘菌素B和替加环素敏感。产NDM-1菌株主要通过质粒实现菌种之间的水平传播，部分菌株可克隆传播[1]。本文对NDM-1阳性菌株进行多次的接合试验，但均未获成功。整合子在菌株耐药性及耐药基因的传递上具有重要意义[7]。但是对于NDM-1阳性菌株的整合子相关基因研究表明，NDM-1并未存在于整合子上（结果未列出）。由此我们推测该基因不存在于可转移的质粒上，可能存在于该菌株的染色体上。对于NDM-1基因在非鲍曼不动杆菌菌株的定位及基因环境尚待进一步研究。

菌株同源性分析结果显示，本院分离亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌存在以A克隆株为主的克隆播散，而NDM-1阳性非鲍曼不动杆菌菌株为散发。院内多重耐药鲍曼不动杆菌感染情况较严重，需加强院感防护，降低或杜绝院内感染的发生。虽然非鲍曼不动杆菌碳青霉烯类耐药分离率不高，但其携带NDM-1基因，仍需加强院感监控，以防院内暴发流行。

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Distribution of NDM-1 Gene in Strains of Acinetobacter sp NIU Dong-mei，

ZHOU Wan-qing，ZHANG Zhi-feng
Department of Medical Laboratory，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing 210008

Objective To investigate the distribution of NDM-1 in Acinetobacter spp. Methods Twenty-five isolates of Acinetobacter baumannii and 3 isolates of A. lwoffii and 2 isolates of A.junnii that were resistant to imipenem were selected for the study. Carbapenemases were screened by modified Hodge test and EDTA disk synergy test. The genotypes of carbapenamases were determined by PCR and DNA sequencing. Plasmid conjugation was performed to study the transfer of carbapenem resistance. Strain homology was analyzed by PFGE. Results Ten out of 25 A. baumannii strains were positive for MHT but all were negative for EDTA disk synergy test，and all the 25 strains were positive with OXA-23-like but negative for NDM-1. All the non-A.baumannii isolates were positive for EDTA disk synergy test but negative for MHT. The strains were just positive for NDM-1 detected by PCRs and negative for the other carbapenamases. The NDM-1 positive strains had different PFGE profiles. PFGE showed high homology for A.baumannii with mainly A clone. Conclusions NDM-1 was distributed in the bacterias rather than A. baumannii，which were resistant to imipenem and the positive isolates had different PFGE profiles.

NDM-1 Acinetobacter Homology

R446.5

A

1671-2587（2017）04-0364-04

2017-01-17）

（本文编辑：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.016

*本课题受中央高校基本科研业务费专项资金（No.021414380025）资助

210002 江苏省南京军区南京总医院检验科（牛冬梅）；南京大学医学院附属鼓楼医院检验科（周万青，张之烽）

牛冬梅（1982–），女，江苏兴化人，主管技师，硕士，主要从事微生物研究，（E-mail）ndm082@163. com。

周万青，（E-mail）zwq_096@163.com。