益气活血组方对急性缺血性心肌大鼠PDGF表达的影响*

胡国恒 龚 纯 王瑾茜 袁 华 陈 亚

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410007）

益气活血组方对急性缺血性心肌大鼠PDGF表达的影响*

胡国恒1△龚 纯2王瑾茜2袁 华1陈 亚1

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410007）

目的 观察益气活血组方对于急性缺血缺氧的心肌组织血管新生的作用及其机制。方法 采用结扎健康的SD雄性大鼠左冠脉的前降支，建立急性缺血缺氧的心肌梗死的模型，造模成功后的45只大鼠随机分为模型组、芪参益气滴丸组、益气活血方组，假手术组15只大鼠模型仅穿线不结扎，各组在根据处死时间随机分为3 d、7 d、14 d 3个时相组。观察不同组别不同时相HE染色情况及血小板衍生生长因子（PDGF）蛋白的表达情况。结果 与假手术组，模型组相比，益气活血组方HE染色可见较多增生的毛细血管；PDGF蛋白表达在芪参益气滴丸组和益气活血组方表达较高（P<0.01），在4个组别的不同时相比较时，发现在芪参益气滴丸组和益气活血组方随着时间增加，蛋白表达量增多（P<0.01），而假手术组和模型组无规律可循。结论益气活血组方可能通过促进PDGF的表达，促进血管新生，增加动脉的密度，形成血管壁，从而可以增加心脏侧支循环，改善心肌的缺血缺氧状态。

益气活血组方 芪参益气滴丸 急性心肌缺血 血管新生 血小板源性生长因子（PDGF）

急性心肌梗死是指诱发于过度劳累、不良情绪或者环境突然改变而发生冠脉粥样硬化斑块脱落引起管腔狭窄或者堵塞，在侧支循环尚未建立的情况下，出现供血与需血不平衡，出现心肌组织严重而持久地缺血。其病情重，致死率高。本病有药物治疗、介入治疗等，但这些治疗手段对已坏死的心肌尚无良好治疗措施，因此难以满足心功能恢复的需要。急性心肌梗死总体预后较差，其并发症多，例如受累心肌在缺血缓解下发生持续性凋亡，出现心肌纤维化及心室重构，由于心肌做功困难，舒缩功能下降，收缩期射血分数下降及舒张期充盈量增多，导致心脏容量负荷加大，进一步出现心力衰竭等［1］。临床上缺乏真正有长期疗效的心肌保护剂。因此，如何促进心肌梗死后期血管新生，避免心肌纤维化及心室重构，且具有长期疗效的治疗手段成为了医学界的一大研究热点。经多项研究表明中医药在促进心肌梗死后血管新生具有明显的疗效［2］，结合它的整体优势，中医药可能将成为保护心肌的新型治疗手段［3］。本研究是在本团队前期研究成果之上提出猜想［4-5］：建立急性心肌梗死的动物模型后，通过观察心脏心肌梗死后大体形态、心肌组织的病理形态（HE染色）、检测血小板源性生长因子（PDGF）蛋白表达（Western-blot）等方面，分析益气活血组方对急性冠脉中断后心肌缺血缺氧的保护机制，并为临床运用“益气活血、祛瘀生新”这一方法治疗心肌梗死提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康的SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠，雄性，体质量（250±30） g，购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SYXK（湘）2011-D03。喂养7 d后方可开始实验，以增强动物的适应性。大鼠喂养环境保持一致，均在湖南中医药大学SPF级实验动物中心饲养。

1.2 实验药物 益气活血组方由黄芪50 g，当归10 g，川芎25 g，丹参25 g组成。中药饮片均购于湖南中医药大学第一附属医院，已由药剂科鉴定为道地药材。制备方法：饮片先浸泡30 min后煎煮2次，第1次加水500 mL，第2次加水300 mL，两次均煎汁150 mL；取2次药液混合后，利用水浴箱水浴浓缩为膏状（含生药0.73 g/mL），存放至-2℃的冰箱冷藏备用。每只大鼠灌胃的液体量为14 mL/kg，按体表面积折算其浓度及等效体积。芪参益气滴丸由黄芪、丹参、三七、降香油组成，规格是每袋0.5 g，由天津天力士制药集团股份有限公司生产。麻醉注射用品戊巴比妥钠注射液由哈药集团三精制药股份有限公司生产。

1.3 试剂与仪器 苏木精 （美国Sigma公司）；伊红（美国 Sigma公司）；APS （美国 Sigma公司）；BSA 粉末（上海 Solarbio公司）；山羊兔抗 IgG（德国 Proteintech三鹰）；Tris（美国 Sigma 公司）等。 呼吸机（ALC-V10）-奥尔科特生物科技有限公司（上海）；心电图机（BL-420F）-光电医用仪器有限公司（上海）；石蜡切片机-Leica公司（德国）；自动封片机-索斯恩Leica公司（德国）等。

1.4 造模方法 大鼠适应新喂养7 d后开始造模，依据标准方法进行造模［6-7］。采用开胸冠脉结扎方法进行，第1步行腹腔注射麻醉，麻醉剂量以1%戊巴比妥钠注射液40 mg/kg的比例计算，麻醉成功后将大鼠固定于鼠板；第2步气管插管，接呼吸机辅助呼吸，动物呼吸机参数设置为呼吸频率90次/min，潮气量10～12 mL，呼吸比2∶1。第3步结扎冠脉。逐层分离皮肤、肌肉等组织后于左肋2～3做横切口撑开，暴露心脏，在左心耳前下方用1根零号无创缝合线结扎左冠状动脉前降支。最后记录标准Ⅱ导联心电图，即刻观察心脏心肌颜色形态的变化，以心肌变白，心电图ST段弓背向上抬高，心肌酶学的改变及左室前壁向外膨胀发绀、搏动减弱为结扎成功标志。假手术组仅穿线不结扎。术后在伤口缝合处涂抹适量青霉素粉以抗感染。

1.5 给药方法 采用随机数字表法，将成功造模大鼠分为模型组、芪参益气滴丸组、益气活血方组，保证每组存活15只。另取假手术组15只。如果每组大鼠在3、7、14 d内出现死亡，则应再次扩大样本量。术后灌胃，假手术组与模型组按照等体积蒸馏水灌胃；芪参益气滴丸组按照药物剂量换算方法 D1∶D2＝R1∶R2（D1 为人的服药剂量、D2为大鼠服药剂量、R1为人的相应体表面积比值、R2为大鼠体表面积比值）换算成300 g大鼠的每日剂量为0.04 g，用蒸馏水溶解稀释到1～1.5 mL/100 g灌胃；益气活血组方组按同样方法换算成300 g大鼠的每日剂量为2.7 g，用蒸馏水溶解稀释到1～1.5 mL/100 g灌胃。

1.6 样本采集与处理 在大鼠冠状动脉结扎术后第3、7、14天，每次每组分批以颈髓离断法处死5只，开胸取出心脏后称质量，然后将心脏组织放在预先准备好的冰块上用锋利刀片在约为心脏乳头肌平面将心脏横切为上下两份，近心尖部梗死区用10%甲醛液固定，约2 min内完成，4℃冰箱保存，用于HE染色，并在光镜下各组选取5个互不重叠的视野，采用IPP6.0图像分析系统，观察梗死区域形态，并计数血管新生的大致面积。近心底部迅速冻存于-80℃冰箱，检测时将心肌匀浆蛋白取出后，采用Western-blot、Quality one软件对灰度进行分析，观察并计算PDGF蛋白相对的表达水平。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示。组内不同时间点的均数比较采用单因素方差分析。同一时间点的组间的均数比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组3 d、7 d、14 d心梗区细胞形态学比较 在光镜下对缺血区心肌组织进行形态学观察，假手术组可见近心尖部梗死区心肌细胞轮廓正常，排列规整，心肌纤维未见明显异常，毛细血管增生不明显。模型组可见心尖部梗死区细胞在3 d组出现细胞肿胀，胞核固缩坏死或出现空泡，细胞结构散乱，后期肌纤维萎缩不明显，有少量毛细血管增生。芪参益气滴丸组在急性缺血缺氧后出现细胞肿胀，坏死，细胞结构散乱，在7 d时开始出现肌纤维萎缩，间质纤维组织增生较明显，14 d时可见较多新生的毛细血管；益气活血组方组在初期如芪参益气滴丸组，后期可见间质纤维组织增生明显，肌纤维萎缩变性，可见较多增生的毛细血管。见图1。

图1 心肌梗死区细胞形态学观察（HE染色，400倍）

图2 各组大鼠心肌组织中PDGF的Western Blot电泳条带

表1 各组大鼠心肌组织中PDGF蛋白表达水平比较

表1 各组大鼠心肌组织中PDGF蛋白表达水平比较

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

组 别 n PDGF蛋白表达假手术组 15模型组 15芪参益气滴丸组 15 0.187±0.068 0.218±0.063 0.545±0.163**益气活血组方组 150.567±0.223**

2.2 各组大鼠心肌组织PDGF蛋白表达比较 见图2，表1。假手术组及模型组PDGF蛋白电泳灰度值与标准蛋白电泳条带（β-action）比较明显减少。芪参益气滴丸组与益气活血方组PDGF蛋白电泳灰度值与标准蛋白电泳条带（β-action）比较明显增高（P<0.01）。2.3 各组大鼠不同时间点心肌组织中PDGF表达水平比较 见图3，表2。假手术组、模型组在3个时相中PDGF蛋白电泳灰度值无明显变化，随着时间变长，灰度值不同程度下降。芪参益气滴丸组与益气活血方组PDGF蛋白电泳灰度值随着时间加长表达明显增高，与假手术组和模型组各时相相比均有显著差异。蛋白灰度值在7 d与14 d较假手术组、模型组有显著差异（P<0.01）。

图3 各时间点AIM大鼠心肌组织中PDGF的Western Blot电泳条带

表2 各组大鼠不同时间点心肌组织中PDGF表达水平比较s）

表2 各组大鼠不同时间点心肌组织中PDGF表达水平比较s）

组 别 n 14 d 3 d 7 d假手术组 15 0.140±0.024模型组 15 0.199±0.018芪参益气滴丸组 15 0.676±0.023**0.157±0.051 0.126±0.005 0.208±0.061 0.215±0.043 0.538±0.052 0.609±0.017**益气活血组方组 15 0.764±0.036**0.585±0.017*0.653±0.053**

3 讨 论

心肌梗死属中医学“真心痛”范畴，《黄帝内经》中对其症状有详细描述，真心痛者，手足青至节，胸痛彻背，背痛彻心等。基本病机为本虚标实，本以气虚为主，标以血瘀为主［8］，在《素问·痹论》中谈到“心痹者，脉不通”“痹……在于脉则血凝而不流”，明确指出了心痛是由于瘀血凝集，心脉痹阻，不通则痛，拘急而剧痛。标实可渐而引起本虚，且真心痛者以中老年居多，本肾气自半，精血渐衰，胸中之宗气不下，脉中之血凝而留止，加重心脉挛急。治疗上瘀血当通，气虚宜补，益气与活血相辅，宗气得补，下行助心脉之血行，则瘀去而脉利，如此治法，标实得通，本虚得补，瘀血去，新血生［9］。

根据“益气活血、祛瘀生新”为治疗原则，本文第1作者胡国恒教授精心组方，在临床上多运用益气活血组方治疗气虚血瘀型真心痛或胸痹，每每可收获良效，可以明显改善心脉瘀滞情况。心脏脉络渐而通畅，心肌得以濡养，故心肌缺血程度降低，心肌梗死后带来的并发症减少。PDGF促进血管新生，侧支循环网络进一步建立，使心肌供血增加，细胞凋亡减少，纤维化及心室重构的程度也随之减小［10］。全方由黄芪、当归、丹参、川芎4味中药组成，虽组方精简，但考虑十分周全。本方以黄芪为君，补元气而通达三焦；大补宗气，下行助血运。臣以当归，活血畅心脉之血行，化瘀通心络之痹阻，使标实得通，兼以行气通止，合君药黄芪使脉气充足以助血行。佐以丹参通心包络祛瘀，川芎活血行气，走而不守，瘀祛而不留。诸药配伍，使元气得复，瘀血得祛，新血相生，脉道滑利，故通而痛止。

PDGF在心肌梗死后促进血管新生得到多个研究的证实。它是一种由A、B肽链构成的具有多种生物学功能的多肽，是促血管新生的生长因子家族中的一员。PDGF受体在毛细血管内皮细胞上表现为高度表达，可使血管发生效应，从而促进血管新生的作用［11］，虽然相对VEGF和bFGF而言，PDGF促血管新生的作用要弱，但在特殊的器官，例如心脏血管显得非常重要［12］。它的作用在于［13］：第一，PDGF-AB产物能够通过促进微血管内皮细胞高表达VEGF、VEGFR-2、von Willebrand，间接使血管新生发生；第二，PDGF能够显著增加动脉密度，有促动脉新生的作用；第三，可促进血管壁生成的作用，其机制是通过血管内皮细胞分泌的PDGF-BB化学趋化作用募集相应受体的平滑肌细胞及周细胞，使其向内皮细胞迁移、黏附，紧密连接后可构成血管壁。这种机制既可限制血管的无限扩大，血管形态得以稳定，又可加强保持血管基底膜的完整性，新的血管有稳固的细胞壁后可防止血管内容物渗漏［14］。第五，调节不同类型的血管收缩，机制是通过抑制内皮衍生舒张因子的合成和刺激内皮细胞诱导一氧化氮的产生而导致的［15］。

本实验研究试通过制备大鼠急性心肌梗死的动物模型，观察心肌急性缺血缺氧后形态学、缺血缺氧性心肌HE染色情况、PDGF蛋白表达。结果表明：1）HE染色结果示，实验组益气活血组方、阳性药物对照组与假手术组、模型组相比，前两者HE染色可见较多增生的毛细血管；2）在促血管新生因子蛋白表达方面，不同组别比较时，PDGF蛋白表达在芪参益气滴丸组和益气活血组方表达较其他组别高；从4个组别的3个时相比较时，发现PDGF在芪参益气滴丸组和益气活血组方随着时间增加，蛋白表达量增多，而假手术组和模型组无此规律可循，可能随着时间的增加而减少。通过本次研究结果的分析，我们可以应证益气活血组方在改善急性心肌梗死大鼠模型的心肌缺血缺氧情况有效，机制可能是通过促进PDGF的高表达，促进新生血管密度的增加，增加心肌供血，且可形成完整的血管壁，紧密而无渗漏［16］。

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Effects of Yiqi Huoxue Decoction on the Expression of PDGF in Rats with Acute Myocardial Ischemia

HU Guoheng，GONG Chun，WANG Jinxi，et al. The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective： To investigate the effect and mechanism of Yiqi Huoxue Decoction on angiogenesis in myocardial tissue of rats with acute ischemia and hypoxia.Methods：A model of acute hypoxic ischemic myocardial infarction was established by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery in healthy SD male rats.After the success of the model，45 rats were randomly divided into the model group，Qishen Yiqi Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group.In the sham operation group，15 rats only wore thread without ligation.According to the execution time，each group was randomly divided into 3 d，7 d and 14 d three phase groups.The HE staining and the expression of platelet-derived growth factor （PDGF） protein were observed in different groups at different time.Results： Compared with the sham operation group and the model group，more hyperplastic capillaries were seen in the HE staining of Yiqi Huoxue Decoction group；the expression of PDGF protein was higher in Qishen Yiqi Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group（P<0.01）.When compared at different time in the four groups，the expression of protein in Qishen Yiqi Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group increased with time （P<0.01），but the sham operation group and the model group had no regularity to follow.Conclusion： Yiqi Huoxue Decoction can promote the expression of PDGF and angiogenesis，increase the density of arteries，and form the wall of blood vessel，thus increasing the collateral circulation of heart and improving the myocardial ischemia and hypoxia.

Yiqi Huoxue Decoction；Qishen Yiqi Decoction；Acute myocardial ischemia；Angiogenesis；Platelet derived growth factor（PDGF）

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1529-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.008

2017-06-07）

湖南省科学技术厅资助项目（2015SK20161，2015SK2016）

△通信作者（电子邮箱：gc89785189@sina.com）