李召卿 王宇 乔宇 武传强 赵明慧 孙姗姗 张仑
STAT3小分子抑制剂HJC0152抑制人头颈部鳞癌细胞株侵袭迁移能力的研究*
李召卿 王宇 乔宇 武传强 赵明慧 孙姗姗 张仑
目的:探讨新型信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)抑制剂HJC0152对人头颈部鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)细胞株侵袭和迁移能力的影响及可能机制。方法:实验分为二甲基亚砜(DMSO)组和HJC0152组。Western blot检测细胞总蛋白中STAT3、p-STAT3 Tyr705/Ser727、MMP-2/9、N/E-cadherin、TWIST1和vi⁃mentin蛋白表达水平及核浆蛋白中的STAT3和p-STAT3 Tyr705/Ser727蛋白表达水平;划痕实验和Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力;免疫荧光实验观察N/E-cadherin蛋白的表达和亚细胞定位。结果:HJC0152组细胞总蛋白和核浆蛋白p-STAT3 Tyr705表达水平均受到显著抑制,而STAT3、p-STAT3 Ser727未见明显变化;总蛋白MMP-2/9、N-cadherin、TWIST1和vimentin表达水平降低,E-cadherin水平升高。HJC0152组细胞向划痕中央移动的距离明显短于DMSO组,通过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞较DMSO组也显著减少。结论:HJC0152可有效抑制头颈鳞癌细胞STAT3 Tyr705的磷酸化,阻碍其发挥转录因子的作用,抑制其下游基因表达,从而干预HNSCC侵袭和迁移能力。
小分子抑制剂 人头颈部鳞癌 肿瘤浸润 上皮-间质转化 STAT3转录因子
AbstractObjective:This study aims to explore the anticancer effects and potential mechanisms of HJC0152,a novel STAT3 inhibitor,on the invasion and migration capacities of human head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC)cell linesin vitro.Methods:Cells were divided into two groups,the dimethyl sulfoxide(DMSO)group and the HJC0152 group in which HNSCC cell lines UM-1 and SCC-15 were treated with DMSO or HJC0152 for 24 h.The total expression levels of STAT3,p-STAT3(Tyr705/Ser727),MMP-2/9,N/E-cadherin,TWIST1,and vimentin;and the cytoplasm and nuclear expression levels of STAT3 and p-STAT3(Tyr705/Ser727)were detected by Western blot assay.Wound healing and Transwell assays were employed to detect the invasion and migration abilities of the UM-1 and SCC-15 cells.The expression and location of N/E-cadherin were visualized by immunofluorescence staining.Results:Western blot indicated that the total expression of p-STAT3(Tyr705),MMP-2/9,N-cadherin,TWIST1,and vimentin were significantly declined and that E-cadherin was remarkably elevated in the HJC0152 group cells compared with that of the DMSO group,with no difference in STAT3 or p-STAT3(Ser727).Cytoplasm and nuclear STAT3(Tyr705)were also inhibited by HJC0152.Wound healing and Transwell assays indicated that tumor invasion and migration capacities were impressively attenuated in the HJC0152 group cells compared to that of the DMSO group.Conclusion:HJC0152 suppresses the phosphorylation of STAT3 at Tyr705 in the HNSCC cell lines,leading to impair transcription activity,deplete expression levels of target genes,and subsequently inhibit migration and invasion capabilities of HNSCC.
Keywords:small molecular inhibitor,human head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC),neoplasm invasiveness,epithelial–mesenchymal transition(EMT),STAT3 transcription factor
作者单位:天津医科大学肿瘤医院颌面耳鼻喉科,国家肿瘤临床医学研究中心,天津市肿瘤防治重点实验室,天津市恶性肿瘤临床医学研究中心(天津市300060)
人头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)在全球恶性肿瘤的发病率居第6位,患者的5年总生存率约为50%[1],超过70%的头颈部鳞状细胞癌患者出现不同程度的复发或转移[2-3]。因此,针对HNSCC治疗的相关研究非常重要。
信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)与肿瘤的侵袭和转移相关[4-5]。当被上游激活信号触发后,STAT3先后经历磷酸化、同源二聚化以及进入细胞核并与相关DNA序列结合等过程,介导下游靶基因的转录[6]。大量证据表明,STAT3第705位酪氨酸残基磷酸化在HNSCC中被异常激活,并可作为一个负向的调节因素影响HNSCC的预后[7]。因此,STAT3是HN⁃SCC潜在的治疗靶点。
HJC0152是氯硝柳胺的衍生物,对STAT3信号传导相较氯硝柳胺有更明显的抑制作用。Chen等[8]通过荧光素酶报告实验证明,HJC0152可以降低STAT3的转录活性,并在动物实验中证明,HJC0152可以显著抑制MDA-MB-231细胞移植瘤的生长。为探究HJC0152抑制HNSCC侵袭转移的作用,本研究进行了一系列体外实验。实验证明,HJC0152有显著的抗癌作用,可有效地抑制HNSCC细胞的侵袭转移能力。
1.1.1 细胞株 人类UM-1和SCC-15头颈部鳞癌细胞系购于美国菌种保藏中心(ATCC)。
1.1.2 实验试剂 DMEM/F-12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购于美国Gibco公司。MMP-2抗体、MMP-9抗体购于美国Santa Cruz公司。STAT3抗体、p-STAT3 Tyr705抗体、p-STAT3 Ser727抗体、vimentin抗体、TWIST1抗体购于美国Abcam公司。E-cad⁃herin抗体、N-cadherin抗体购于美国BD公司。组蛋白H3抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。GAPDH抗体、山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗购于北京中杉金桥公司。BCA蛋白试剂盒购于美国Thermo Fisher公司。Matrigel基质胶购于美国BD公司。多聚甲醛和结晶紫购于美国Solorbio公司。Transwell小室购于美国Corning公司。HJC0152由美国德克萨斯大学医学部的周嘉博士提供。
1.2.1 细胞培养和实验分组 UM-1/SCC-15细胞系以含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化细胞,2~3d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。实验分为2组,二甲基亚砜(DMSO)组:将与HJC0152组中HJC0152等体积的DMSO加入UM-1和SCC-15的细胞培养基内;HJC0152组:以HJC0152终浓度为3.481 μM(半数抑制浓度IC50)和2.749 μM(IC50)的培养基处理UM-1和SCC-15。
1.2.2 MTT法检测HJC0152对UM-1/SCC-15细胞的增殖抑制作用 取对数生长期细胞消化离心,重悬后,调整细胞浓度为2.5×105/mL,以200 μL/孔接种于96孔板,贴壁过夜后按照0、0.01、0.1、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L浓度加入HJC0152,设置6个复孔。加药后培养24 h,然后每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,继续培养4 h后吸去培养液,每孔加入DMSO 150 μL,震荡10 min使晶体充分溶解,酶标仪(490 nm波长)测得每孔光密度(optical density,OD)值。
1.2.3 划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期UM-1和SCC-15细胞接种于6孔板,待细胞融合度达到80%~90%后用无菌20 μL枪头垂直于6孔板平面进行划痕,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗去刮掉的细胞,然后加入不含血清的培养基。实验孔加入HJC0152,使其终浓度达到3.5 μM(UM-1)或2.75 μM(SCC-15),对照孔加入等量的DMSO。此时记为划痕0 h,分别在0 h和培养48 h时于倒置显微镜观察并拍照,测量各组细胞向划痕中央迁移的距离。
1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭迁移能力 检测细胞迁移能力和侵袭能力分别使用无Matrigel和有Matrigel包被的Transwell小室。小室用Matrigel胶包被后放入24孔板中,置于孵箱内过夜。取对数生长期UM-1和SCC-15细胞,根据实验分组处理24 h后,胰酶消化,PBS清洗后用不含血清的培养基重悬,以5.0×104/孔细胞量接种于Transwell上室中,下室加600 μL含20%胎牛血清的培养基。孵箱内培养16 h后,用4%多聚甲醛固定跨膜的细胞,并用0.1%结晶紫染色。使用倒置显微镜采集图像,对4个不同视野的穿过膜细胞计数,求平均值。
1.2.5 Western blot分析相关蛋白的表达 常规培养对数生长期口腔鳞癌细胞UM-1和SCC-15,按实验分组分别处理细胞24 h,PBS清洗2遍,在细胞中加入含1%PMSF和1%蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA,裂解30 min,离心后收取上清液。应用凯基核浆蛋白提取试剂盒按说明书提取细胞核浆蛋白。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品用4×loading buffer稀释,然后95℃加热10 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳(载30μg蛋白),用孔直径为0.45 μm的PVDF膜转膜。5%的脱脂奶粉封闭1 h,在 4℃分别孵 STAT3、p-STAT3 Tyr705、p-STAT3 Ser727、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、vi⁃mentin和TWIST1的一抗(1:1 000稀释)以及GAPDH(1:2 000稀释)一抗过夜,用加Tween的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)漂洗3次后,孵辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:2 000)1 h,TBST漂洗后,加ECL发光试剂用C-DiGit印记扫描仪(LI-COR)检测结果。
1.2.6 免疫荧光法检测UM-1/SCC-15细胞内N/E-cadherin的表达 取对数期细胞接种于24孔板中的无菌玻片爬片,每孔约2万个细胞。按实验分组处理细胞48 h,PBS洗3次后用4%多聚甲醛固定15 min,再用10%BSA室温封闭30 min,加鼠抗人单克隆N/E-cadherin抗体(1∶200),4℃孵育过夜,再用FITC标记的抗小鼠IgG二抗(1∶500)室温孵育1 h,于488 nm激光下观察荧光强度。
每个实验至少重复3次,应用SPSS 22软件进行统计学分析,结果采用±s表示,两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
MTT法测得HJC0152对UM-1和SCC-15的IC50分别为3.481 μM和2.749 μM(图1),本研究将此作为干预HNSCC细胞的药物浓度。
图1 MTT法测定UM-1和SCC-15细胞系中HJC0152的半数抑制率Figure 1 IC50of HJC0152 in UM-1 and SCC-15 determined by MTT
Western blot结果表明,经HJC0152处理后,细胞总蛋白中p-STAT3 Tyr705水平明显下降,而p-STAT3 Ser727水平未见改变;细胞核蛋白和浆蛋白中STAT3磷酸化水平的变化与总蛋白一致(图2)。
图2 HJC0152对STAT3蛋白活性位点磷酸化的影响Figure 2 Effect of HJC0152 on STAT3 phosphorylation level
实验结果表明,划痕48 h后,HJC0152组的头颈鳞癌细胞系向中央迁移的距离较DMSO组明显减少(图3)。UM-1细胞DMSO组和HJC0152组向划痕中央迁移的距离分别为(505.5±39.94)μm和(189.45±18.29)μm,P<0.01;SCC-15细胞DMSO组和HJC0152组向划痕中央迁移的距离分别为(499.28±49.35)μm和(228.76±28.56)μm,P<0.01。
Transwell实验结果显示,不论是侵袭实验还是迁移实验,HJC0152组的细胞相比DMSO组穿过Transwell小孔的细胞数都明显减少(图3)。在迁移实验中,UM-1细胞DMSO组和实验组穿过小室的细胞数分别是(439±25.9)个/视野和(94±19.9)个/视野,P<0.01;SCC-15细胞DMSO组和实验组穿过小室的细胞数分别是(227±49.6)个/视野和(48.5±12.6)个/视野,P<0.01。在侵袭实验中,UM-1细胞DMSO组和实验组穿过小室的细胞数分别是(108±24.7)个/视野和(39±12.7)个/视野,P<0.01;SCC-15细胞DMSO组和实验组穿过小室的细胞数分别是(191±37.1)个/视野和(64±14.7)个/视野,P<0.01。此外,Western blot显示,HJC0152组MMP-2和MMP-9表达水平也显著降低(图4)。
经HJC0152处理后,UM-1和SCC-15细胞中TWIST1蛋白和vimentin蛋白的表达均下降,此外,N-cadherin蛋白表达量明显下降,而E-cadherin蛋白表达上升(图4)。免疫荧光显示,HJC0152处理后,细胞内E-cadherin蛋白表达增强,N-cadherin蛋白表达减弱(图5)。
图3 HJC0152对人头颈部鳞癌迁移侵袭能力的影响Figure 3 Effect of HJC0152 on migration and invasion capacities in human HNSCC
图4 HJC0152对侵袭性和EMT相关标志蛋白表达的影响Figure 4 Effect of HJC0152 on invasion and the expression of EMT biomarkers
图5 免疫荧光检测HJC0152对N-cadherin和E-cadherin表达水平的影响Figure 5 Effect of HJC0152 on the expression levels of N-cadherin and E-cadherin detected by immunofluorescence staining
肿瘤局部侵犯与远处转移是HNSCC患者的主要死因之一,多数患者在就诊时已发生区域淋巴结转移(43%)或远处播散(10%),失去手术治疗的机会,预后较差。据统计,HNSCCⅠ期患者的生存率可达到80%,Ⅲ期和Ⅳ期患者的生存降至40%[9],而远处转移患者的病死率约90%[10]。因此,肿瘤的侵袭转移对肿瘤患者的预后有非常重要的影响。
STAT3是经典的信号转导与转录激活因子,在各组织细胞中广泛表达。一方面,正常细胞内,STAT3受白介素、表皮生长因子等激活,在细胞的增殖、分化、存活、凋亡、转化和细胞免疫等方面发挥着重要作用[11];另一方面,在许多人类的恶性肿瘤中,都发现有异常激活的STAT3通路,促进肿瘤的发生发展。研究证实,STAT3信号通路的异常激活与人头颈部鳞癌的生长[12]、耐药[13]和侵袭转移[14]都密切相关。
HJC0152是一种新型的STAT3靶向抑制剂,对STAT3的转录活性有很强的抑制能力,并且水溶性和口服生物利用度较佳[8]。本研究中,经HJC0152药物处理后,HNSCC细胞株的STAT3和p-STAT3 Ser727水平不受影响,而p-STAT3 Tyr705水平明显下降,说明HJC0152可特异性地抑制STAT3 Tyr705的磷酸化。据报道,Tyr705的磷酸化是STAT3转录激活的重要标志[15],当Tyr705磷酸化受到抑制,STAT3作为转录因子的功能会被削弱。
MMP是肿瘤侵袭进程中的关键酶,参与肿瘤细胞外基质的降解,促进肿瘤的局部浸润和远处转移,且其表达水平与淋巴结转移相关,对判断疾病预后有重要意义[16]。其中MMP-2和MMP-9作为重要的STAT3下游转录调控靶点,已被证实与HNSCC的侵袭转移能力有关。通过HJC0152处理后,本研究观察到UM-1和SCC-15细胞内MMP-2和MMP-9的表达水平显著降低。与此同时,在Transwell侵袭实验中,经HJC0152处理的UM-1和SCC-15细胞侵袭能力较DMSO组明显减弱。这提示药物可有效地干预肿瘤细胞对外基质的降解,抑制肿瘤侵犯和转移。
另一方面,EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系[17],而STAT3的活化已被证明可通过介导EMT进程[18],促进HNSCC的转移[10,19]。为检测HJC0152对HNSCC细胞株EMT的影响,本研究用Western blot法检测HJC0152处理前后,UM-1和SCC-15细胞内EMT相关生物标志物的表达水平变化。TWIST1已被证实可通过调节细胞黏附相关基因的表达从而介导EMT[10];而vimentin是间质细胞中控制细胞运动的细丝状蛋白,vimentin高表达的原发HNSCC肿瘤转移率显著升高[20];E-cadherin和N-cadherin是表达在膜表面的钙黏蛋白,E-cadherin降低、N-cadherin升高被称作“钙黏蛋白转换”,是EMT进程发动的重要标志。Western blot结果表明,HJC0152组vimentin、TWIST1和N-cadherin的表达量明显下降,而E-cadherin明显上升。这提示HJC0152通过抑制STAT3 Tyr705的磷酸化降低其转录活性,下调其下游基因TWIST1和VIM的表达,同时调节E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达,从而逆转EMT进程,抑制UM-1和SCC-15细胞侵袭和迁移的能力。
综上所述,HJC0152作为STAT3的一个新型靶向抑制剂,可有效抑制STAT3第705位酪氨酸的磷酸化,影响其发挥转录调控与转录激活因子的作用,干预肿瘤降解细胞外基质的能力,削弱HNSCC细胞EMT趋势,从而起到抑制HNSCC细胞侵袭转移能力的抗肿瘤效果。
致谢:感谢美国德克萨斯大学医学部的周嘉博士提供HJC0152药物。
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(2017-04-20收稿)
(2017-08-10修回)
(编辑:武斌 校对:杨红欣)
Anticancer effects and underlying mechanisms of HJC0152,a small-molecule STAT3 inhibitor,on tumor invasion and migration in human head and neck squamous cell carcinoma
Zhaoqing LI,Yu WANG,Yu QIAO,Chuanqiang WU,Minghui ZHAO,Shanshan SUN,Lun ZHANG
10.3969/j.issn.1000-8179.2017.17.454
Correspondence to:Lun ZHANG;E-mail:zhanglunsubmission@163.com
Department of Maxillofacial and Ear Nose Throat Oncology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81572492)
*本文课题受国家自然科学基金项目(编号:81572492)资助
张仑 zhanglunsubmission@163.com
李召卿 专业方向为人头颈部鳞癌的基础研究。
E-mail:idoclee@163.com