JNK/FOXO3信号通路介导黄连素促人肺腺癌PC-9细胞凋亡的研究

刘红岗 赖远阳 朱以芳 同李平 董小平 许娟 张勇 郭海华 李小飞 闫小龙

JNK/FOXO3信号通路介导黄连素促人肺腺癌PC-9细胞凋亡的研究

刘红岗 赖远阳 朱以芳 同李平 董小平 许娟 张勇 郭海华 李小飞 闫小龙

目的：探讨黄连素（berberine，Ber）诱导肺腺癌PC-9细胞凋亡及c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/转录因子叉头蛋白3（forkhead box protein O3，FOXO3）信号通路的作用机制。方法：实验采用完全随机化的分组方法，分为对照组、Ber组（30、60 μM），分别检测各组PC-9细胞活力值、凋亡率、ROS含量、caspase 3活性、线粒体膜电位，以及JNK/FOXO3通路和凋亡相关蛋白含量的变化。SP600125特异性抑制JNK（磷酸化）激活后，Ber（0、60 μM）处理细胞24 h，重复上述检测。结果：Ber有效抑制PC-9细胞活力，促进细胞凋亡（P＜0.05），显著降低PC-9细胞线粒体膜电位，增加ROS含量和caspase 3活性（P＜0.05），并呈浓度依赖效应；Western blot检测结果显示Ber上调p-JNK、FOXO3和Bax的含量（P＜0.05），下调p-FOXO3和Bcl-2的含量（P＜0.05）；SP600125特异性抑制JNK激活后，拮抗Ber下调p-FOXO3含量及其促PC-9细胞凋亡作用（P＜0.05）。结论：Ber可有效抑制肺腺癌PC-9细胞活力、促进细胞凋亡和氧化应激损伤，作用机制可能与上调p-JNK、FOXO3含量和抑制FOXO3磷酸化有关。

黄连素 肺腺癌 PC-9 JNK FOXO3 凋亡

AbstractObjective:To investigate the pro-apoptotic effect of berberine(Ber)on human lung adenocarcinoma PC-9 cell line,and to detect the role of c-Jun N-terminal kinase(JNK)/forkhead box protein O3(FOXO3)signaling in this process.Methods:The PC-9 cells were randomly divided into the control group and the Ber group,which was treated with 30 and 60 μM Ber.The survival rate,apoptotic rate,ROS generation,caspase-3 activity,and mitochondrial membrane potential of cells were detected.Western blot was performed to detect the expression of JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins.A JNK-specific activation inhibitor,SP600125,was used to block the phosphorylation of FOXO3 in PC-9 cells,and then treated with Ber(30 and 60 μM)for further detection after 24 h.Results:Ber treatment resulted in an obvious reduction in cell viability,promotion of cell apoptosis,downregulation of mitochondrial membrane potential,and an increase of ROS and caspase-3 in a dose-dependent manner.Western blot analysis demonstrated that Ber treatment resulted in a significant upregulation of p-JNK,FOXO3,and Bax expression,and a downregulation of p-FOXO3 and Bcl2 levels.Moreover,the inhibition of JNK activation by SP600125 antagonized the anti-FOXO3 phosphorylation role and the pro-apoptotic role of Ber on PC-9 cells.Conclusion:Ber treatment effectively inhibits the viability of PC-9 cells and enhances apoptosis and oxidative stress injury,which may be related to the upregulation of p-JNK and FOXO3 and the downregulation of p-FOXO3.

Keywords:berberine,lung adenocarcinoma,PC-9,JNK,FOXO3,apoptosis

黄连素又称小檗碱（berberine，Ber），是从毛莨科植物黄连等中药中提取的异喹啉类生物碱［1-2］，具有抗乳腺癌、肺癌及胃肠道肿瘤等作用，其机制与促进肿瘤细胞凋亡和抑制增殖等相关［2-4］。转录因子叉头蛋白3（forkhead box protein O3，FOXO3）作为抑癌因子参与抑制乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡［5-6］。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员之一，持续活化（磷酸化）的JNK可以激活Bcl-2超家族（Bax、Bim、BAD），抑制FOXOs超家族磷酸化后出核降解，进而促进肿瘤细胞凋亡［7-8］。研究发现Ber可激活FOXO3促进肝癌HepG2细胞凋亡［9］，激活JNK促进乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡［10］。然而，Ber在肺腺癌中的作用机制尚未明确。本研究观察Ber对肺腺癌PC-9细胞活力、凋亡及JNK/FOXO3通路的影响，研究JNK/FOXO3信号通路是否参与Ber诱导的PC-9细胞凋亡过程，为拓展Ber及靶向JNK/FOXO3信号通路抗肺腺癌提供理论基础。

作者单位：空军军医大学唐都医院胸外科（西安市710038）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 肺腺癌PC-9细胞系购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。黄连素（Ber），2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），二甲基亚砜（DMSO），噻唑蓝（MTT）均购自美国Sigma公司。DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司。JNK，p-JNK（Thr183/Tyr185），FOXO3，p-FOXO3；B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl-2相关X蛋白（Bax）和β-肌动蛋白（βactin）抗体均购自美国Abcam公司。辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。JNK抑制剂SP600125购自美国Sigma公司。线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自江苏南京碧云天试剂公司。TUNEL检测试剂盒购自德国Roche公司。ROS检测试剂盒及Caspase-Glo®3/7定量试剂盒购自美国Promega公司。

1.1.2 细胞培养 PC-9细胞使用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL链霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培养基培养于37℃、5%CO2湿化孵箱中。细胞融合后，使用0.25%胰蛋白酶消化，根据实验将细胞接种于不同的培养板中。

1.2 方法

1.2.1 噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力值 实验分为对照组、Ber（30、60 μM）组、处理24 h组。Ber先以DMSO溶解，使用时以无血清DMEM高糖培养基稀释，使DMSO浓度低于0.1%，滤菌后4℃保存备用。以每孔7×103个细胞接种于96孔板，每组设6个复孔，各处理24 h后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。加入100 μL无血清的高糖DMEM和10 μL的MTT试剂，37℃孵育4 h后，弃去培养液，加入100 μL的DMSO原液，振荡15 min，使结晶完全溶解，用酶标仪（波长为490 nm）测定其吸光值（OD值），该实验重复3次。

1.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡率 细胞培养于共聚焦皿中，于4℃用4%的多聚甲醛固定15 min。PBS洗涤3次，0.1%的Triton X-100打孔15 min，PBS洗涤1次。严格按照TUNEL法试剂盒的说明进行操作。在共聚焦显微镜下观察，其中凋亡细胞为绿色荧光，细胞核为蓝色荧光，随机选取10个视野计数，计算凋亡率。

1.2.3 JC-1染色检测细胞线粒体膜电位 细胞培养3×105个/L种于共聚焦皿中，进行相应处理后，加入JC-1染色工作液，细胞培养箱中37℃孵育20 min，配置适量JC-1染色缓冲液（1×）放置冰浴，染色结束后采用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次，加入细胞培养液在共聚焦显微镜下观察，其中低线粒体膜电位细胞为绿色荧光，正常线粒体膜电位细胞为红色荧光，随机选取10个视野计数，计算低线粒体膜电位细胞数目比值。

1.2.4 caspase 3活性测定 以每孔3×106个细胞接种于6孔板，各组细胞处理结束后，收集细胞并裂解提取细胞蛋白。之后每孔加入100 μL Caspase-Glo⑧3/7工作液和一定量的细胞裂解液，室温下避光孵育1 h，酶标仪检测荧光强度（波长为400～405 nm）。

1.2.5 ROS含量测定 荧光探针DCFH-DA检测ROS水平：根据实验分组处理后将细胞消化并悬浮于DCFH-DA浓度为20 mol/L的PBS中，CO2培养箱孵育细胞2 h，用酶标仪检测其荧光强度（激发光波长设为485 nm，发射光波长设为530 nm）。酶活性=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.2.6 Western blot检测 肺腺癌PC-9细胞在裂解缓冲液中匀浆裂解，以12 000 r/min，离心15 min。收集上清液，根据蛋白定量试剂盒说明测定蛋白含量，并调各组蛋白浓度一致。高温水煮变性冷却后，蛋白行SDS-聚丙烯凝胶电泳（PAGE）并转移至硝酸纤维素膜上，将膜浸入含20%脱脂奶粉的TBST缓冲液，室温封闭2 h，分别用对应的一抗4℃孵育12 h。洗膜后用对应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，洗涤3次，最后用电化学发光试剂显影，并用软件分析蛋白的相对表达量（Bio-Rad，West Berkeley，Cal⁃ifornia，USA），重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞活性检测

不同浓度Ber（30、60 μM）处理 PC-9细胞 24 h后，相差显微镜下观察细胞形态（图1A）。可见Ber可使PC-9细胞变圆、收缩甚至脱落，且Ber浓度越高，变化越明显。MMT法检测各组细胞活力值的统计学分析，相较于对照组，可见Ber呈浓度依赖有效抑制PC-9细胞的活力（P＜0.05，图1B）。

2.2 细胞凋亡率检测

与对照组相比，不同浓度Ber（24 h）可以有效诱导PC-9细胞凋亡（P＜0.05），且呈浓度依赖性（图2）。

图1 不同浓度Ber处理24 h抑制PC-9细胞活力Figure 1 Ber treatment inhibited PC-9 cell viability(24h)

图2 不同浓度Ber处理24 h对各组细胞凋亡率的影响Figure 2 Effect of Ber treatment on the apoptosis of PC9 cells(24 h)

2.3 线粒体膜电位JC-1染色、ROS含量及caspase3活性测定

与对照组相比，不同浓度Ber（24 h）可以使PC-9细胞线粒体膜电位降低，ROS含量增加，caspase 3活性升高（P＜0.05），并呈浓度依赖性（图3）。

2.4 Western blot检测

不同浓度Ber处理PC-9细胞24 h后，提取总蛋白并行Western blot检测JNK/FOXO3通路和凋亡相关蛋白表达的变化。结果表明，与对照组比较，Ber处理组细胞p-JNK、FOXO3和Bax的表达量上升，而p-FOXO3和Bcl-2的表达下降，且Ber浓度越高变化越明显（P＜0.05），说明Ber处理可以激活JNK信号通路、促进FOXO3表达且抑制FOXO3磷酸化进而促进PC-9细胞凋亡（图4）。

2.5 20 μM SP600125抑制PC-9细胞JNK磷酸化后各项检测

不同处理组（20 μM SP600125，Control，60 μM Ber，20 μM SP600125+60 μM Ber）处理PC-9细胞24 h后，相比于Control组，PC-9细胞细胞活力结果为（97.651±4.130%，100.000±0.000%，53.654±7.825%，75.611±8.625%，P＜0.05）、caspase3活性检测结果为（98.214±10.690% ，100.000±0.000% ，288.514±27.381%，180.403±24.560%，P＜0.05）。结果表明与对照组相比，20 μM SP600125单独处理对PC-9细胞活力和caspase3活性无显著影响（P＞0.05）；然而，应用20 μM SP600125处理抑制JNK激活后，Ber降低PC-9细胞活力及增强细胞内caspase3活性的能力受到明显抑制。JNK/FOXO3通路和凋亡相关蛋白表达的变化，相比于60 μM Ber组，20 μM SP600125+60 μM Ber组p-JNK、Bax的表达明显减少，p-FOXO3和Bcl-2表达显著提高（P＜0.05）；而JNK和FOXO3表达无显著差异（P＞0.05），说明SP600125抑制JNK磷酸化可上调FOXO3的磷酸化水平，进而拮抗Ber的促凋亡作用（图5）。

图3 不同浓度Ber处理24 h对各组细胞JC-1线粒体膜电位、ROS含量及caspase3活性的影响Figure 3 Effect of Ber treatment on JC-1 mitochondrial membrane potential,ROS content,and caspase-3 activity of PC9 cells(24 h)

图4 Ber处理24 h对PC-9细胞JNK/FOXO3通路和凋亡相关蛋白表达的影响Figure 4 Effect of Ber treatment on JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins of PC9 cells(24 h)

图5 不同处理方法处理PC细胞24 h对JNK/FOXO3通路和凋亡相关蛋白表达的影响Figure 5 Effect of different treatments on JNK/FOXO3 signaling and apoptosis-related proteins of PC9 cells(24 h)

3 讨论

Ber是一种国内临床常用的中成药，具有显著的抑菌功效，多用于治疗肠道细菌感染、细菌性痢疾等。此外，研究发现Ber对肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤具有明确的抑制作用［1-2］，其机制与抑制肿瘤细胞周期，下调血管内皮生长因子抗肿瘤血管生成，减少基质金属蛋白酶表达抗肿瘤转移，诱导内质网应激和氧化应激反应促进细胞凋亡等作用有关［2-4，11-12］。本研究发现，Ber具有显著的抗肺癌作用，可有效降低人肺腺癌PC-9细胞活力，提高氧化应激标志因子ROS含量，增强凋亡因子caspase3活性和降低细胞线粒体膜电位进而促进细胞凋亡，以上结果提示Ber诱导的PC-9细胞凋亡与激活氧化应激损伤有关。

FOXO3作为一种抑癌因子，其激活具有抗肿瘤作用，如抗乳腺癌、肝癌、肺癌等［5-6，13］。研究表明FOXO3进入细胞核后可调控p21、p27、FasL、TRAIL、Bim等多种抑癌因子表达，进而促进肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期、抑制肿瘤转移［5，13］。FOXO3具有多种化学修饰作用，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化［5，14］。FOXO3 的磷酸化可抑制 FOXO3 的转录活性，促进其从细胞核向细胞质转移并在细胞质中被降解，从而抑制FOXO3的抗肿瘤作用［5］。JNK是MAPK家族成员之一，持续活化（磷酸化）的JNK可以抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白的激活，抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白对FOXOs磷酸化作用，减少FOXOs磷酸化后出核降解，进而促进肿瘤细胞凋亡［7-8，15］。

既往研究表明Ber可激活JNK，转录后上调Bax含量、抑制Bcl-2表达，进而促进乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡［10］，激活 FOXO3促进肝癌HepG2细胞凋亡［9］。本研究发现，应用Ber可以显著提高p-JNK和FOXO3在肺腺癌PC-9细胞中的表达，下调p-FOXO3的含量，抑制FOXO3磷酸化后的降解进而上调FOXO3含量。此外，应用JNK特异性抑制SP600125后可明显抑制JNK的激活并上调p-FOXO3含量，抑制Ber对PC-9细胞的促凋亡作用，上调抗凋亡蛋白Bcl-2含量并抑制促凋亡蛋白Bax表达。以上研究结果表明，Ber诱导的肺腺癌细胞凋亡作用可能与上调p-JNK、FOXO3含量和抑制FOXO3磷酸化有关。然而，Ber在抗肺腺癌中的具体作用机制尚未完全明确，Ber是如何激活JNK和上调FOXO3表达，以及JNK是否通过抑制PI3K、Akt及14-3-3蛋白的激活降低FOXO3磷酸化仍需深入研究。

[1]Vuddanda PR,Chakraborty S,Singh S.Berberine:a potential phytochemical with multispectrum therapeutic activities[J].Expert Opin Investig Drugs,2010,19(10):1297-1307.

[2]Wang N,Tan HY,Li L,et al.Berberine and Coptidis Rhizoma as potential anticancer agents:Recent updates and future perspectives[J].J Ethnopharmacol,2015,176:35-48.

[3]Li-Weber M.Targeting apoptosis pathways in cancer by Chinese medicine[J].Cancer Lett,2013,332(2):304-312.

[4]Ortiz LM,Lombardi P,Tillhon M,et al.Berberine,an epiphany against cancer[J].Molecules,2014,19(8):12349-12367.

[5]Coomans de Brachene A,Demoulin JB.FOXO transcription factors in cancer development and therapy[J].Cell Mol Life Sci,2016,73(6):1159-1172.

[6]Bullock M.FOXO factors and breast cancer:outfoxing endocrine resistance[J].Endocr Relat Cancer,2016,23(2):R113-130.

[7]Liu J,Lin A.Role of JNK activation in apoptosis:a double-edged sword[J].Cell Res,2005,15(1):36-42.

[8]Wagner EF,Nebreda AR.Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development[J].Nat Rev Cancer,2009,9(8):537-549.

[9]Shukla S,Rizvi F,Raisuddin S,et al.FoxO proteins'nuclear retention and BH3-only protein Bim induction evoke mitochondrial dysfunction-mediated apoptosis in berberine-treated HepG2 cells[J].Free Radic Biol Med,2014,76:185-199.

[10]Xie J,Xu Y,Huang X,et al.Berberine-induced apoptosis in human breast cancer cells is mediated by reactive oxygen species generation and mitochondrial-related apoptotic pathway[J].Tumour Biol,2015,36(2):1279-1288.

[11]Pham TP,Kwon J,Shin J.Berberine exerts anti-adipogenic activity through up-regulation of C/EBP inhibitors,CHOP and DEC2[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,413(2):376-382.

[12]Eom KS,Kim HJ,So HS,et al.Berberine-induced apoptosis in human glioblastoma T98G cells is mediated by endoplasmic reticulum stress accompanying reactive oxygen species and mitochondrial dysfunction[J].Biol Pharm Bull,2010,33(10):1644-1649.

[13]Zheng F,Tang Q,Wu J,et al.p38alpha MAPK-mediated induction and interaction of FOXO3a and p53 contribute to the inhibitedgrowth and induced-apoptosis of human lung adenocarcinoma cells by berberine[J].J Exp Clin Cancer Res,2014,33:36.

[14]Martins R,Lithgow GJ,Link W.Long live FOXO:unraveling the role of FOXO proteins in aging and longevity[J].Aging Cell,2016,15(2):196-207.

[15]Wang X,Chen WR,Xing D.A pathway from JNK through decreased ERK and Akt activities for FOXO3a nuclear translocation in response to UV irradiation[J].J Cell Physiol,2012,227(3):1168-1178.

（2017-03-19收稿）

（2017-06-09修回）

Berberine exerts pro-apoptotic effects on PC-9 cells via activation of JNK/FOXO3 signaling

Honggang LIU,Yuanyang LAI,Yifang ZHU,Liping TONG,Xiaoping DONG,Juan XU,Yong ZHANG,Haihua GUO,Xiaofei LI,Xiaolong YAN

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.17.316

Correspondence to:Xiaolong YAN;E-mail:yanxiaolong@fmmu.edu.cn

Department of Thoracic Surgery,Tangdu Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710038,China

闫小龙 yanxiaolong@fmmu.edu.cn

刘红岗 专业方向为胸外科常见病多发病的诊治。

E-mail：drliuhg@163.com