心痛泰颗粒对动脉粥样硬化小鼠血脂及TNF-α、IL-6影响的实验研究

谭娣娣 李 雅△ 郭志华 易 琼 刘建和 谢帆慈 刘 俊

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007）

动脉粥样硬化（AS）系指血脂和血管壁成分逐渐改变的动脉疾病，常易损害弹性动脉和弹性纤维肌性动脉［1］。脂类物质不断累积动脉血管内膜，使得内膜纤维逐渐变厚，病变深处则由坏死组织、细胞外脂质池等成分组成。血压、血脂、血糖、同型半胱氨酸水平异常等是AS的发生的常见原因。炎症反应是动脉粥样硬化发生的核心机制，伴随着AS从发生发展到恶变的所有变化情况［2］。血脂异常刺激血管内皮细胞可引起炎性细胞释放，逐渐转移至内皮下，转换成巨噬细胞，吞灭组织脂蛋白并转化为泡沫细胞，演变为脂质斑块，不稳定粥样斑块易引起出血、钙化、血栓、动脉瘤等，导致急性心脑血管事件［3］。研究表明［4］中医药针对动脉粥样硬化的不同病理环节能够同时发挥作用，可以降低血脂、控制炎症反应、改善血管内皮功能，可明显减轻急性冠脉综合征的临床征象。导师根据多年的临床经验，自拟活血化瘀、理气止痛之中成药心痛泰颗粒，用于临床治疗动脉粥样硬化，临床疗效显著。本研究按照AS小鼠模型动物实验，选取有关指标，讨论心痛泰颗粒治疗动脉粥样硬化的临床效果，替心痛泰在临床的进一步推行使用提供可靠根据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级4周龄雄性ApoE-/-小鼠 42 只（品系：C57BL/6J），体质量（18±4） g，野生型小鼠（7BL/6J12）12只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。动物许可证：SCXK（京）2012-0001；合格证号No.11400700009674。

1.2 试药与仪器 心痛泰颗粒的制备：中药饮片均购于湖南中医药大学第一附属医院药剂科。丹参15 g，川芎 10 g，三七 3 g，葛根 10 g，郁金 10 g，山楂 15 g，木香5 g，枳壳10 g，炙甘草5 g。两次水煎提取1 h，过滤，浓缩，微波干燥后粉碎制粒，加部分糊精做成颗粒剂，60℃以下干燥整粒，将成品颗粒装袋分存，放于阴凉干燥处保存备用。阿托伐他汀钙片：购于湖南中医药大学第一附属医院药房。生产商：北京嘉林药业股份有限公（国药准字号H19990258）。总胆固醇（TC）（保定长城临床实践有限公司，9004-1）、三酰甘油（TG）（保定长城临床实践有限公司，9003-1）、高密度脂蛋白（HDL-C）（浙江东瓯诊断产品有限公司，A0-10037）、低密度脂蛋白（LDL-C）（长春汇利生物技术有限公司，A029）、 一抗 Rabbit-anti-12320、E-cacdherin-11A24、Fas-L-BA0049（武汉博士德生物工程有限公司）、pv-9000二步法免疫组化检测试剂（北京中杉金桥，A0210）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6 试剂盒（上海浩然生物技术有限公司，150-04）、0.9%氯化钠注射液（湖南科伦制药有限公司，H4302045）、水合氯醛（天津科密欧试剂有限公司，4218-2009）。主要仪器：电子天平TP-2200B（湘仪天平仪器设备有限公司，TP-2200B）、高速离心机 （湘仪天平仪器设备有限公司，TG16-WS）、全自动生化分析仪（日本东芝医疗系统株式会社，TBA-120FR）、切片机 （德国徕卡公司，RM2235）、显微图像摄影系统（美国Bio-Rad公司，mini protean 3 cell）、-80℃超低温冰箱 （中科美菱，MDF-U74V）、60℃电热恒温干燥箱（中兴伟业仪器有限公司，101A-8）、电子恒溫不锈钢水浴锅（Leica莱卡仪器有限公司，HI1210）。

1.3 造模与分组 实验组选用4周龄雄性ApoE-/-小鼠42只，圈喂于湖南中医药大学SPF级实验室，予高脂饮食（0.15%胆固醇+21%脂肪+普通鼠料）喂养；空白组选取野生型小鼠12只，喂予普通饲料。连续喂养12周后，从两种小鼠中各随机取出2只，摘眼球取血检测发现实验组TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平明显升高；HE染色后观测ApoE-/-小鼠主动脉有明显动脉粥样斑块形成，表明AS模型制备成功（见图1）。造模成功后，将剩下的40只ApoE-/-小鼠按随机数字表法分成4组，分别为模型组、心痛泰低、高剂量组、阿托伐他汀钙组（他汀组）各10只，外加空白组10只。空白组和实验组灌胃每日1次，持续8周。空白组、模型组予以0.9%氯化钠注射液灌胃，灌胃容积为15 mL/kg；心痛泰低剂量组按 3 g/（kg·d）（相当于成人日用药量 10 g）、心痛泰颗粒高剂量组按12 g/（kg·d）（相当于成人日用药量 40 g）、他汀组按 3mg/（kg·d）（相当于成人日用药量20mg）灌胃。以上均按照“人-动物体表面等效剂量比值公式”折算。

图1 造模成功（HE染色，100倍）

1.4 标本采集与检测 1）检测血脂指标，在AS小鼠灌胃结束后，摘眼球采血 1～1.5mL，3000 r/min，10min离心分离血清，采上清液，置于小试管中，-80℃保存，采用酶法检测 TC、TG，比色法检测 LDL-C、HDL-C。2）采用ELISA法检测血清TNF-α、IL-6浓度，摘眼球采血、凝集、取血清，将酶复合物稀释，加血清及阴性、阳性对照，经过孵育、洗板、加底物，避光反应后加终止液并读数。3）采用免疫组化法测定TNF-α、IL-6的表达水平，石蜡切片、脱水、缓冲液清洗，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，滴加非免疫动物血清20min，滴加一抗、PBS冲洗、滴加二抗、冲洗后加ABC复合物、DAB显色，在400倍显微镜下观察，用MIAS图像分析系统分析，按照免疫组化染色阳性细胞数在每一高倍视野中所占比例依次统计。

1.5 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（±s）表示。组间对比如满足正态性检验，选用单因素方差分析，其中方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane′s T2分析；不满足正态性检验用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血脂浓度比较 见表1。与空白组比较，其他各组小鼠血脂差异有统计学意义（P＜0.05），提示造模成功。与模型组相比，心痛泰颗粒低、高剂量组、他汀组均能显著降低TC、TG、LDL-C水平，且心痛泰颗粒高剂量组比低剂量组效果好（P＜0.05）；而心痛泰颗粒高剂量组与他汀组组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，心痛泰颗粒低剂量组、高剂量组、他汀组均能上增HDL-C，组间差异无统计学意义 （P＞0.05）。

表1 各组血脂浓度比较（mmol/L，±s）

表1 各组血脂浓度比较（mmol/L，±s）

与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与低剂量组比较，▲P＜0.05。 下同。

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2.2 各组血清TNF-α、IL-6水平比较 见表2。与空白组对比，其他各组小鼠TNF-α、IL-6浓度有明显差异（P＜0.05），提示造模成功。与模型组相比，心痛泰颗粒低剂量组、高剂量组、他汀组均都能明显降低TNF-α、IL-6水平（P＜0.05），并且高剂量组、他汀组优于低剂量组（P＜0.05），他汀组优于高剂量组（P＜0.05）。

表2 各组 TNF-α、IL-6 水平比较（mmol/L，±s）

表2 各组 TNF-α、IL-6 水平比较（mmol/L，±s）

组 别 n空白组 10模型组 10低剂量组 10 TNF-α IL-6 0.23±0.02 0.34±0.06 60.13±8.23△ 58.82±9.21△16.25±1.98△* 14.32±0.83△*高剂量组 10 5.33±0.15△*▲ 6.08±0.22△*▲他汀组 10 4.35±1.33△*▲ 4.17±0.66△*▲

2.3 各组TNF-α、IL-6阳性表达比较 见表3。与空白组相比，其他各组小鼠TNF-α、IL-6阳性表达有显然区别（P＜0.05），提示造模成功。跟模型组对比，心痛泰颗粒低剂量组、高剂量组、他汀组均能明显下调TNF-α、IL-6 阳性表达率（P＜0.05），并且高剂量组、他汀组优于低剂量组（P＜0.05），他汀组优于高剂量组（P＜0.05）。

表3 各组TNF-α、IL-6阳性表达率比较（%，±s）

表3 各组TNF-α、IL-6阳性表达率比较（%，±s）

组 别 n空白组 10模型组 10低剂量组 10 TNF-α IL-6 1.05±0.10 1.04±0.09 27.89±4.07△ 28.88±4.06△14.12±1.75△* 15.10±1.72△*高剂量组 10 8.99±1.24△*▲ 7.98±1.25△*▲他汀组 10 5.33±0.91△*▲ 4.33±0.88△*▲

2.4 免疫组化图像 见图2，图3。取主动脉于400倍光镜下观察。空白组动脉管壁相对均匀，为淡蓝色浅染；模型组动脉管壁周围棕黄色深染，为中等阳性；心痛泰各组和阿托伐他汀钙组动脉管壁内膜脂质浸润比模型组轻，为弱阳性。

图2 TNF-α免疫组化图像（HE染色，400倍）

图3 IL-6免疫组化图像（HE染色，400倍）

3 讨 论

AS以脂代谢异常为基础，伴有纤维组织增生、血管内皮细胞增生、动脉中层渐渐退化、动脉内膜斑块出现，导致动脉壁增厚变硬，血管腔狭窄甚至完全闭塞，组织器官缺血缺氧或坏死为主要病变特征的一种慢性疾病［5］。血脂紊乱是导致AS发生和发展的始动及危险因素，各种异常的血浆脂球蛋白沉积动脉血管管壁，导致血管内膜的病变。血液中各种血浆脂球蛋白改变均会不同程度推动疾病的演变过程，LDL扮演着非常危险的角色，可以明显增加心血管事件的进展，降低LDL含量可明显改善心脑血管疾病患者的生存质量［6］。相反，作为AS的保护性脂蛋白，HDL含量越高越能延缓动脉粥样硬化的形成和进展。

TNF-α可以诱导血小板粘附聚集，介导平滑肌细胞增殖，刺激内皮损伤、参与脂质浸润过程，引起病变进展及斑块变化，诱发斑块脱落，导致血栓发生。IL-6可促使血小板活化，加快凝血进程，引起内皮及平滑肌细胞发生病变并坏死，加快AS的形成，加快ACS和脑卒中的发生发展。IL-6可损伤血管内皮，干预巨噬细胞对LDL摄取，使得脂质在血管壁累积，导致AS。此外，血管内皮受损能加快TNF-α应答，TNF-α亦能引起IL-6反应，两者不断产生炎症反应，导致免疫物质围绕血管内皮，血栓出现［7］。抗炎和降血脂治疗可以减慢并逆转粥样斑块的病变过程，并且能够调控粥样斑块，改善病患的临床症状，降低并防止急性心脑血管事件进一步恶变发展。

中医学中没有“动脉粥样硬化”这名称，按其临床表现，属中医学“胸痹心痛”“脉痹”“血浊”等范围［8］。 病性属本虚标实，气滞、痰浊、血瘀是标，气血阴阳亏虚、肝肾不足是本。本病发病主要与心、肝、肺、脾脏密切相关，心气的助力、肺气的输布、肝气的疏泄、脾气的转输均推动着血在管腔中环绕运行。气机阻滞难以推动血液的运行，从而瘀滞不通；血瘀日久，又反作用于气机郁滞，因此气血实属两个互根互用的存亡体，说明了气滞血瘀是AS发生的重要病理基础［9］。针对气滞血瘀型动脉粥样硬化的治疗，心痛泰颗粒具有活血化瘀、理气止痛的功效。全方由丹参、川芎、三七、郁金、山楂、木香、葛根、枳壳、炙甘草组成。方中丹参活血祛瘀止痛，与“血中气药”川芎合用为君；三七散瘀消肿止痛，郁金行气解郁，山楂行气散瘀，木香理气止痛，四药助君药加强调畅气机，祛瘀止痛之功效，合而为臣；佐以葛根解肌退热，枳壳理气化痰，一升一降共调气机；使以炙甘草调和诸药。诸药配伍，使气机畅，瘀血散，胸阳振，气血调，脉络得以濡养，从而达到抗动脉粥样硬化的作用［10-15］。

本动物实验结果表明，心痛泰能明显下调AS小鼠TC、TG、LDL-C浓度，上调HDL-C水平，可抑制TNF-α、IL-6的阳性表达，改善动脉组织病理变化，缩小粥样斑块面积，提示心痛泰可能通过降脂、减轻动脉炎症、调控斑块来达到抗动脉粥样硬化的目的。

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