补肾通络方对大鼠膝骨关节炎膝关节软骨细胞外基质代谢的影响

杨 帆，袁 芳，侯秀娟，朱跃兰*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是临床上常见的一种渐进性、退行性关节病变[1-2]。OA发病的具体机制尚不是十分明确，对OA的治疗只能局限于对症处理。目前对OA的发生机制主要认为是关节表面的软骨组织遭到破坏[3-4]。本研究通过运用RT-PCR及Western blot技术检测补肾通络方对KOA大鼠膝关节软骨中的MMP-3/13和TIMP-1的mRNA水平及ADAMTs-4蛋白表达情况，在分子生物学层面探讨本方治疗KOA的相关作用机制，为其应用于临床提供科学依据。

1 实验材料

1.1 动物 普通级Wistar大鼠42只，雄性，体质量180～220 g，由北京斯贝福生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养于中国中医科学院医学实验中心的普通环境中，恒温恒湿，水瓶给水，自由进食，普通饲料喂养。

1.2 主要药品、试剂和仪器 主要药品：美洛昔康片（7.5 mg/片，购自于上海勃林格殷格翰药业有限公司，国药准字：H20090789），抗骨增生胶囊（0.35 g/粒，购自于江苏康缘药业股份有限公司，国药准字：Z10980006），补肾通络方（原药材每剂含量：骨碎补9 g，桑寄生15 g，川牛膝12 g，鸡血藤15 g，白芍12 g，穿山龙15 g，川芎10 g，由北京中医药大学东方医院颗粒药房提供，制成颗粒后每付药质量为10 g）。

主要试剂：木瓜蛋白酶（25 g/瓶，北京索莱宝科技有限公司提供），UltraPure Agarose、SuperScript III RT反转录kit（ABI-invitrogen提供），Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP（MDL提供，MD2142），Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP（MDL提 供，MD2141）， 寡核苷酸引物oligo（dt）和逆转录酶RTase（购自于GIBCO公司）等。

主要仪器：低温高速离心机5810R（Eppendorf AG公司产品），核酸浓度测定仪（THERMO公司产品），ABI 7900 Q-PCR仪（Applied biosystems公司产品），电泳仪和凝胶成像仪（biorad公司产品）等。

1.3 各基因引物设计 Real-time PCR检测目的基因引物，以下引物均在北京Invitrogen公司合成。见表1。

表1 各基因引物序列

2 实验方法

2.1 模型复制 参照文献[5]方法配制4%木瓜蛋白酶生理盐水溶液，每次于大鼠双侧后肢膝关节腔内注射0.2 mL/肢，分别于造模的第1、4、7天进行注射，方法与剂量相同，共3次。正常组大鼠不注射任何溶液。2.2 分组及给药 购进后适应性喂养1周再制备KOA模型。模型制备成功后按照随机数字表法将42只Wistar大鼠随机分为7组，分别为正常组（I）、模型组（II）、西药组（III）、成药组（IV）、中药低剂量组（V）、中药中剂量组（VI）和中药高剂量组（VII），每组分别为6只。造模成功后第2天即可开始给药，正常组及模型组大鼠均给予蒸馏水灌胃10 mL/kg。根据大鼠与人的体表面积比值进行换算后[6]，西药组大鼠给予0.781 3 mg/kg的美洛昔康制成的混悬液灌胃，成药组大鼠给予0.546 9 g/kg的抗骨增生胶囊制成的混悬液灌胃，中药低、中、高剂量组分别予0.52 g/kg、1.04 g/kg、2.08 g/kg的补肾通络颗粒制成的混悬液灌胃。灌胃给药1次/d，连续4周。

2.3 RT-PCR测定方法 依据文献[7]的方法，取膝关节腔内股骨内外侧髁及胫骨平台退变区的软骨约10 mg置于Trizol液1 mL中匀浆，加入氯仿200 μL混匀，1 400 r/min 离心15 min。取上清加入等体积异丙醇，12 000 r/min离心10 min。弃上清，加入75%乙醇混匀，10 000 r/min离心5 min。弃上清，用50 μL无菌DEPC处理过的三蒸水溶解沉淀以完成总RNA的提取。之后进行扩增条带：95 ℃预变性2 min，将PCR反应溶液置于Real-time PCR仪上进入40个PCR反应，（94 ℃变性20 s；65 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s）；72 ℃延伸5 min。PCR产物与100 bp DNA Ladder在2 %琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带，扩增产物在1.5 %琼脂糖凝胶上电泳，紫外投射仪下观察扩增产物特异条带。为建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后继续从72 ℃缓慢加热到99 ℃（每5 s升高1 ℃）。

2.4 Western blot测定方法 依据文献[8]，取软骨组织标本置于研钵中加入少量液氮进行研磨，再加入裂解液100 μL，冰上充分裂解30 min，4 ℃离心（1 200 r/min，15 min）取上清，离心反复3遍。用核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，取300 μg总蛋白，加缓冲液，放入100 ℃水浴锅中煮10 min使蛋白变性。配制10 %分离胶和4 %浓缩液，安装电泳相关仪器，加入目标蛋白10 μL，最后一个泳道加入标准蛋白Marker。电泳完毕后以半干转膜法将蛋白转印于PVDF膜上，5 %脱脂奶粉封闭抗原1 h，加入含ADAMTs-4一抗（1:1 000稀释）室温孵育2 h后4 ℃过夜；次日洗膜后加入辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗（1:35 000稀释）室温下孵育1 h，洗膜，ECL化学发光检测杂交信号，X线片压片曝光，凝胶图像分析其积分光密度值。其中ADAMTs-4蛋白表达水平用β-actin蛋白表达量校正。

2.5 观察指标 1）一般状态观察：给药干预期间观察大鼠体质量、精神状态、活动、饮水及摄食情况。2）膝关节软骨中mRNA和蛋白含量测定：分别用RTPCR法检测软骨中MMP-3、MMP-13和TIMP-1的mRNA表达；Western blot法检测软骨中ADAMTs-4蛋白水平。

2.6 统计学分析 所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示。若符合正态分布，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；若非正态，采用非参数秩和检验（Mann-Whitney U），以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 大鼠体质量及一般状态的影响比较 正常组大鼠状态良好，毛发光泽，活动自如，饮水及进食量适中，体质量在给药期间平稳上升；其余各组大鼠在第一次造模后即出现双侧后肢膝关节活动受限，主动活动量减少，不喜饮水进食，毛发脱失、无光泽，体质量减轻。造模成功后第2天开始给药，在给药基线期，各组大鼠的体质量差异无统计学意义，具有可比性；各组在给药期间体质量逐渐增加。见表2。

表2 各组大鼠给药期间体质量比较（ ，n = 5） g

表2 各组大鼠给药期间体质量比较（ ，n = 5） g

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别 给药前 给药后7 d 给药后14 d 给药后21 d 给药后28 d I 240.54±8.40 300.74±19.96 358.67±26.52 413.95±30.28 415.03±41.20 II 158.04±14.35 203.44±28.21# 262.36±23.94# 318.40±19.16# 352.01±14.92#III 194.76±8.49 251.15±10.94#△ 306.32±11.13#△ 351.95±16.35#△ 365.87±12.60#△IV 193.01±15.02 250.57±14.33#△ 304.47±17.90#△ 350.89±19.21#△ 363.93±20.92#△V 179.92±18.65 234.65±25.11#△ 284.37±24.17#△ 335.61±26.97#△ 346.47±28.89#VI 187.83±9.12 241.64±15.89#△ 294.85±12.11#△ 346.71±10.56#△ 364.83±15.80#△VII 183.12±7.83 246.54±10.84#△ 282.95±24.13#△ 342.04±23.39#△ 356.79±26.40#

3.2 MMP-3、MMP-13和 TIMP1的 mRNA表达 MMP-3、MMP-13和TIMP-1的相对定量，以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法分析，可知其表达情况。对各组的2-△△Ct值进行统计学分析，见表3（插页一）。MMP-3和MMP-13的mRNA表达情况是模型组最高（P＜0.05），正常组最低（P＜0.05），不同的药物对其影响不同，其中补肾通络方的中剂量组表达在各给药组中最小，成药组的表达在各给药组中最大，补肾通络方中剂量组与高剂量组相比，中剂量组低于高剂量组，然二者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。TIMP-1的mRNA含量情况是在模型组中最低（P＜0.05），而在正常组中最多（P＜0.05），在各给药组中补肾通络方的高剂量组含量接近正常组，而低剂量组的表达最少。

3.3 ADAMTs-4的蛋白表达 以β-actin作为内参，将ADAMTs-4的灰度值与β-actin的比值作为ADAMTs-4的相对表达量（见表4、图2）：模型组中含量最高（P＜0.05），正常组中含量最低（P＜0.05），不同给药组含量不同，成药组最高而高剂量组最低，但之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组MMP-3/13和TIMP-1的mRNA表达的2-△△Ct值（ ，n = 5）

表3 各组MMP-3/13和TIMP-1的mRNA表达的2-△△Ct值（ ，n = 5）

注：与正常组相比，# P＜0.05；与模型组相比，△P＜0.05

组别 MMP-3 MMP-13 TIMP-1 I 0.06±0.01 0.25±0.04 2.82±0.32 II 1.00±0.26# 2.35±0.29# 0.18±0.02#III 0.49±0.10△ 0.55±0.12△ 0.64±0.10△IV 0.96±0.16 1.23±0.35△ 0.80±0.18△V 0.57±0.08△ 0.99±0.17△ 0.39±0.07 VI 0.13±0.01△ 0.32±0.03△ 0.88±0.24△VII 0.20±0.05△ 0.98±0.11△ 2.46±0.15△

表4 各组ADAMTs-4蛋白相对灰度值（ ，n = 5）

表4 各组ADAMTs-4蛋白相对灰度值（ ，n = 5）

注：与正常组相比，# P＜0.05

I II III IV V VI VII ADAMTs-4 0.47±0.13 0.67±0.09# 0.57±0.09 0.66±0.08# 0.60±0.14 0.58±0.15 0.56±0.11

图2 各组软骨中ADAMTs-4蛋白表达情况

4 讨论

OA是以关节软骨发生变性、破坏及骨质增生为特征的疾病。目前研究表明，OA不仅仅是单一的软骨结构病变，而是同时涉及软骨下骨和滑膜的整个关节病变[9]。既往研究表明，OA的发生是由软骨细胞外基质发生蛋白水解引起的[10]。软骨细胞外基质的主要成分是聚蛋白多糖，在疾病发展早期，ADAMTs-4是软骨基质蛋白聚蛋白多糖的主要降解酶，观察关节软骨中ADAMTs-4蛋白的表达对疾病发展有一定的指导意义[11]。MMP-3/13是具有破坏软骨组织中的主要成分II型胶原蛋白的作用[12]，进而促进软骨细胞的降解。TIMP-1是由巨噬细胞合成的，对胶原酶和基质水解酶有特异性的抑制作用。TIMPs具有除了抑制已经激活的MMPs，还可阻止或延缓MMPs由酶原型向激活型转变的作用[13]，对软骨细胞具有保护作用，防治软骨细胞发生或进一步加重。

OA按中医理论为“痹病”“骨痹”，肝肾亏虚、气血不足是其本，风寒湿邪侵袭、瘀血阻滞为其标[14]，而补肾通络方具有补益肝肾、强筋壮骨、活血化瘀、舒筋通络，标本兼治的功效。且前多项研究表明补肾通络方对KOA治疗有效[15-16]，但其具体的作用机制尚不明确。

本研究结果显示，模型组MMP-3/13和ADAMTs-4的表达均明显高于于正常组，验证KOA大鼠软骨因MMP-3/13和ADAMTs-4的影响受到破坏，参与软骨退行性改变的过程，而各给药组其含量均有不同程度的降低，总体以补肾通络方含量较低，表明补肾通络方具有保护软骨的作用，ADAMTs-4的表达在各给药组间差异无统计学意义，可能由于样本量较小，导致数据统计差异无统计学意义；TIMP-1的表达是在模型组最低，而经过给药干预后，其含量有所升高，且在各给药组中补肾通络方高剂量组含量接近正常组，而在低剂量组表达最少，可说明药物的干预能够有效地增加TIMP-1的含量，保护软骨细胞发生破坏，且浓度越高，保护作用越强。因此，补肾通络方能够明显地降低MMPs和ADAMTs-4在软骨中的表达，增加TIMP-1在软骨中的表达，进而抑制炎性反应的发生、减少关节软骨基质的破坏而起到保护关节软骨的作用。

综述所述，MMPs和ADAMTs-4参与KOA的病理过程，通过早期应用补肾通络方治疗KOA能够显著地降低MMPs和ADAMTs-4的表达，增加TIMP-1的表达，可以为KOA的治疗提供新的理论依据。

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