拔罐疗法对寒凝血瘀型家兔局部皮肤相关因子影响的实验研究

刘华朋，杨 静，朱成慧，李丹丹，朴盛爱，孟向文

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.南阳市第一人民医院儿二科，河南 南阳 473000；3.天津市滨海新区大沽社区卫生服务中心，天津 300450；4.天津市第四中心医院，天津 300143；5.烟台凤凰山医院，山东烟台 264003；6.天津中医药大学针灸推拿学院，天津 300193）

2016年里约热内卢奥运会，在美国游泳队和体操队的明星效应下，国际运动界带起一股“拔罐热”[1]。拔罐疗法是中医学的重要组成部分，在中国经历了数千年的积淀与发展，内涵深邃，具有系统的理论体系、丰富的实践经验及显著的临床疗效，是一种兼保健与治疗的自然疗法，因其取材简便，疗效独特，临床应用广泛，是中国传统医学的宝贵财富[2-3]。中医手法包括拔罐疗法是调理人体"亚健康"状态最适宜的手段,在人类健康产业的发展中发挥巨大的作用[4]。目前国内关于拔罐疗法的研究大多集中在临床疗效上，但有关拔罐疗法作用机制研究相对不足[5]，主要集中在罐斑、血流量、免疫影响等方面。本实验选用家兔拔罐局部皮肤相关因子的变化作为寒凝血瘀证研究的指标，以阐述拔罐疗法从局部到整体良性调整的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及仪器 1） 实验动物：中国实验用家兔20只，体质量（2±0.2）kg，雌雄不拘。动物在实验前在天津中医药大学动物饲养中心适应性驯养1周，实验动物造模在天津中医药大学动物实验室进行，饲养期间集中给以混合家兔饲料喂养，兔舍室温介于22～26℃，相对湿度为40%～60%，自然昼夜，自由取食及饮水，每天用自来水刷洗兔笼以保持清洁。 2）实验仪器：低温高速离心机，家兔固定器，常规手术器械，真空注射器，采血管。3）实验试剂：PBS缓冲液 博士德；VEGF酶联免疫试剂盒 博士德；INOS酶联免疫试剂盒 博士德；Histostain-Plus Mouse Primary USA；Histostain-Plus Rabbit Primary USADAB Kit USA。

1.2 分组

1.2.1 分组 家兔适应性饲养1周后，将20只家兔按体质量随机分为空白对照组（简称空白组）、寒凝血瘀模型组（共4组），其中空白组4只，模型组16只，对每组家兔分别进行编号。

1.2.2 动物模型制备 拟采用冰冷刺激的方法复制寒凝血瘀家兔模型。具体方法如下：对动物分组完毕，将清醒状态下的家兔置于兔板上俯卧位固定，后背暴露在外，用宠物剪将20只家兔后背大椎与至阳之间约5 cm×7 cm范围区间剃毛，模型组、治疗组家兔固定在兔板上，在大椎穴（《国家标准腧穴名称与定位GB/T12346-2006》）上固定冰袋1 h，连续10 d，3组进行平衡实验，空白组同法固定，不进行任何干预。

1.2.3 拔罐选穴与方法

1.2.3.1 治疗取穴 大椎穴：以常用实验动物穴位定位图谱为依据，并参照《腧穴名称与定位》（GB/T12346-2006）和中国畜牧兽医学会编写的《中国兽医针灸学》，结合比较解剖学和骨度分寸法为依据进行动物穴位模拟定位。

1.2.3.2 拔罐方法 造模成功后第2日起，每日同一时间将拔罐组家兔固定在兔板上，采用罐压为-0.03Mpa分别在家兔后背督脉大椎穴、大椎下依次拔3个罐，时间为10 min，连续7 d；拔罐14 d组家兔则按上述拔罐方法连续拔罐14 d；拔罐21 d组家兔按上述方法连续拔罐21 d。空白组和模型组动物同法固定，不进行拔罐疗法治疗。

1.3 指标检测

1.3.1 测量指标及测量方法 运用免疫组化法检测寒凝血瘀家兔拔罐局部皮肤生长因子VEGF和炎性因子iNOS含量变化，运用抗氧化法检测寒凝血瘀家兔拔罐局部皮肤超氧化物歧化酶SOD含量变化。

1.3.2 取材 分别于拔罐后7 d、14 d、21 d，从空白组、模型组家兔中随机处死2只，同时处死相应拔罐组。拔罐组动物取拔罐位置皮肤组织，空白组和模型组取拔罐组动物拔罐位置相对应处皮肤组织。1）将切取的皮肤组织浸泡并固定于4%多聚甲醛溶液中24～48 h，行常规脱水、浸蜡，制备石蜡包埋标本，常规切片进行免疫组化染色，光镜半定量观察VEGF和iNOS表达情况。2）取皮肤组织放入Eppendorf管中，迅速投入液氮中保存，待测皮肤组织中VEGF和iNOS表达情况。

2 实验结果

2.1 运用酶标仪和标准曲线计算样本中VEGF和iNOS的含量。

2.2 在光学显微镜下阅片结合主观认识判断样本中VEGF、EGF、iNOS阳性染色的目标及强弱。

2.3 采用羟胺法测定和计算SOD的含量。

2.4 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析，所有数据均以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 拔罐干预后家兔皮肤酶联免疫分析结果 拔罐干预后，分别取各组家兔对应处皮肤，检测皮肤VEGF和iNOS含量，见表1。

表1 拔罐干预寒凝血瘀型家兔皮肤组织VEGF和iNOS含量变化（ ，n = 4） ng/L

表1 拔罐干预寒凝血瘀型家兔皮肤组织VEGF和iNOS含量变化（ ，n = 4） ng/L

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△ P＜0.05

分组 VEGF/（ng/L） iNOS/（U/L）空白组 68.85±1.57 4.10±0.38模型组 58.85±5.68# 4.32±0.15#拔罐7 d组 81.43±6.78△ 4.16±0.11拔罐14 d组 64.02±1.57△ 4.08±0.31拔罐21 d组 59.23±6.58△ 4.12±0.23

3.2 拔罐干预后寒凝血瘀型家兔局部皮肤免疫组化切片结果 1）拔罐干预后寒凝血瘀型家兔大椎穴拔罐处免疫切片后VEGF含量呈阳性表现，褐色细胞浆处为阳性表现部位。由图1（插页二）可见，VEGF在造模后阳性表达减弱，拔罐7 d后阳性表达增强，拔罐14 d后阳性表达有所减弱，拔罐21 d后阳性表达又有所增强。2）拔罐干预后寒凝血瘀型家兔大椎穴拔罐处免疫切片后EGF含量呈阳性表现，褐色细胞浆处为阳性表现部位。由图2（插页二）可见EGF阳性表达在造模后减弱，拔罐7 d后阳性表达增强，拔罐14 d后阳性表达持续增强，拔罐21 d阳性表达更加明显。

3.3 拔罐干预后寒凝血瘀型家兔大椎穴拔罐处免疫切片后iNOS含量呈阳性表现，褐色细胞浆处为阳性表现部位。由图3（插页二）可见，iNOS阳性表达造模后增强，拔罐7 d后减弱，拔罐14 d后持续减弱，拔罐21 d后阳性表达更加减弱。

3.4 家兔皮肤抗氧化测定超氧化物歧化酶SOD结果拔罐干预后，分别取各组家兔对应处皮肤，检测皮肤中超氧化物歧化酶含量，见表2。

表2 家兔皮肤组织SOD含量变化（ ，n = 4）mg/mL

表2 家兔皮肤组织SOD含量变化（ ，n = 4）mg/mL

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△ P＜0.05

分 组 SOD空白组 0.24±0.02模型组 0.21±0.02#拔罐7天组 0.24±0.01△拔罐14天组 0.24±0.01△拔罐21天组 0.27±0.02△

4 结论

实验结果显示，造模可使家兔的局部皮肤中VEGF的含量减低，经过一定周期的拔罐疗法治疗，可使VEGF的含量回升，但是随拔罐时间的延长，VEGF含量又有所下降。由此可见，不同拔罐时间干预治疗可以使VEGF含量升高，诱导血管生成，但是随干预时间和强度的加强，其含量又被调控至稍高于原始水平。由此推断，拔罐作用可以通过改变VEGF含量诱导血管生成和增强血管通透性。

造模可使家兔产生炎症反应，局部皮肤组织中的iNOS含量升高。实验结果显示，通过不同拔罐时间干预治疗可以使iNOS含量减低，但未出现统计学意义，有待进一步研究。

实验中的寒凝血瘀家兔皮肤组织中SOD的含量较空白组降低并有统计学意义，不同拔罐时间干预治疗后SOD含量又上升并有统计学意义，由此推断拔罐疗法可能具有清除自由基的作用，但含量变化与拔罐时间无明显相关性。

5 讨论

传统中医学认为，人体是一个有机的整体，五脏六腑、四肢百骸各个部位都不是孤立存在的，而是内外相通、表里相应、彼此协调、相互为用的整体。拔罐作用于体表皮肤，通过脏腑、经络、气血等的整体作用从而起到调整某些脏腑的功能及扶正祛邪、平衡阴阳的功效。杨金生等[6]把拔罐的功能总结为以下方面：抵抗外邪，保卫机体；活血化瘀，疏通经络；调整气血，平衡阴阳；反映病候，协助诊断。王富春等[7]提出拔罐疗法在机体自我调整中产生行气活血、舒筋通络、消肿止痛、祛风除湿等功效，起到一种良性刺激，促使机体恢复正常功能的作用。

现代医学目前对于拔罐疗法机制的探讨主要是围绕其对免疫系统的影响而展开论述的。对于拔罐机制的实验研究多集中于负压作用对罐斑的影响[8-10]，拔罐局部血流量[11-12]、氧分压变化[13]及其对免疫功能影响[14-15]等方面。

本实验中选取的血管内皮生长因子（VEGF），是一种对血管生成有极强诱导作用的多功能诱导因子，能特异性作用于血管内皮细胞，具有促进血管内皮细胞分裂、增殖、细胞质钙聚集以及诱导血管生成和使血管通透性增强等作用[16-17]。

实验结果显示，寒凝血瘀模型可使家兔的VEGF的含量减低，经过一定周期的拔罐疗法治疗，可使VEGF的含量回升，但是随拔罐时间的延长，VEGF含量又有所下降，并介于空白组和模型组之间。由此可见拔罐疗法可以使血管内皮生长因子含量升高，诱导血管生成，但是随干预时间和强度的加强，其含量又被调控至稍高于原始水平。由此推断，拔罐作用可以通过改变VEGF含量诱导血管生成和增强血管通透性。

表皮生长因子（EGF）是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用[18]。朱成慧等[19]发现通过拔罐疗法，实验动物外周血中EGF可有明显改变。本实验的结果亦显示，家兔局部皮肤中的EGF含量在寒凝血瘀模型建立后，阳性表达减弱，拔罐干预后阳性表达增强，由此推断拔罐作用可以通过改变EGF含量，促进表皮细胞增殖。

寒凝血瘀模型可使家兔产生炎症反应，局部皮肤组织中的iNOS含量升高。本实验结果显示，通过拔罐疗法干预可以使iNOS含量减低，其中 iNOS含量随拔罐干预、拔罐时间的延长减低程度越明显。

本实验中的寒凝血瘀家兔皮肤组织中SOD的含量较空白组降低并有统计学意义，拔罐治疗后SOD含量又上升并有统计学意义，由此推断拔罐疗法具有清除自由基的作用。

总之，通过研究寒凝血瘀家兔模型拔罐前后局部皮肤的生长因子、炎性因子的蛋白表达，证实拔罐干预后，拔罐局部皮下血管扩张，炎症反应减轻。推断拔罐疗法可能首先对局部皮肤产生良性物理刺激，改善微循环，通过影响生长、炎性因子等表达产生持续弱刺激，形成级联反应，进而影响整体微循环，产生拔罐疗法的“通络”效应。

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