江苏省句容市灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性

肖 婷， 陈 露， 张建华， 芮东明， 许 媛， 吉沐祥， 杨敬辉

(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400)

灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的，该菌寄主范围广泛，可侵染多种水果、蔬菜和观赏植物的叶、茎、花以及果实，给生产造成严重损失。控制病害发展的化学常规用药以多菌灵、腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺等杀菌剂为主打药剂[1-3]。啶酰菌胺属于新型烟酰胺类杀菌剂[4]，主要用于防治腐烂病、白粉病和灰霉病等，该类药剂作为线粒体呼吸链中琥珀酸辅酶Q还原酶的抑制剂，对孢子萌发有很强的抑制能力，且与其他杀菌剂无交互抗性。近几年,啶酰菌胺在中国大量使用，但由于琥珀酸脱氨酶抑制剂(SDHIs)类杀菌剂属于单一作用位点类型，其抗性风险备受关注，与其相关的抗药性研究也已经有很多报道[5-9]，这些抗性菌株可能与靶标位点的改变或多药抗药性机制有关。田间最常见的灰葡萄孢菌(B.cinerea)对啶酰菌胺的抗性是由于SdhB亚基上第272位上的氨基酸(H272Y/R)突变所致[10]，也有报道称SdhB亚基上第272位点上组氨酸突变为亮氨酸(H272L)也会引起菌株的抗药性，但此类型发现较少[11-12]。另外，SdhB亚基上第225位点由脯氨酸突变为苯丙氨酸(P225F)、苏氨酸(P225T)或亮氨酸(P225L)，第230位点天冬氨酸突变为异亮氨酸(N230I)都是引起菌株抗性的原因[13-14]。

本研究拟结合本地区生产实际，连续2年采集设施葡萄和设施草莓的灰霉病菌，结合农户化学防治主打药剂，检测本地区灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性，分析抗药性的发展过程，并通过分子手段揭示抗性机理，明晰突变种类和分布，以期为生产中科学用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2015年和2016年分别在江苏省句容市葡萄、草莓主产区随机采集灰霉病菌(B.cinerea)，实验室分离获得单孢菌株(表1)，采用滤纸片法将其保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2 供试药剂

98.95%啶酰菌胺原药，由先正达公司提供。药剂均用丙酮配制成10 000 mg/L的母液，母液置于4 ℃下保存备用。

表1菌株信息

Table1InformationofBotrytiscinereaisolatescollectedinJurong，Jiangsuprovince

菌株号菌株数作物地点时间PTB16-2、PTB16-4、PTB16-5、PTB16-8、PTB16-9、PTB16-11、PTB16-12、PTB16-14、PTB16-159葡萄唐庄2016PTB16-17、PTB16-18、PTB16-19、PTB16-204葡萄兴发葡萄园2016PTB16-24、PTB16-25、PTB16-26、PTB16-28、PTB16-29、PTB16-36、PTB16-397葡萄柳埝2016PTB16-49、PTB16-50、PTB16-51、PTB16-52、PTB16-69、PTB16-70、PTB16-71、PTB16-72、PTB16-75、PTB16-79、PTB16-81、PTB16-82、PTB16-83、PTB16-84、PTB16-85、PTB16-88、PTB16-86、PTB16-87、PTB16-8919葡萄白兔2016PTB16-58、PTB16-59、PTB16-60、PTB16-614葡萄倪塘2016PTB16-31、PTB16-32、PTB16-343葡萄华阳镇2016PTB16-93、PTB16-96、PTB16-101、PTB16-102、PTB16-107、PTB16-1096葡萄茅山镇2016B15-11、B15-14、B15-15、B15-16、B15-19、B15-38、B15-39、B15-40、B15-52、B15-53、B15-54、B15-6012草莓茅山镇2015B15-21、B15-26、B15-27、B15-61、B15-64、B15-656草莓后白镇2015B15-2、B15-8、B15-9、B15-104草莓天王镇2015B15-214、B15-217、B15-227、B15-216、B15-2255草莓淳化镇2015B15-239、B15-250、B15-251、B15-249、B15-252、B15-253、B15-2547草莓土桥镇2015B15-78、B15-82、B15-146、B15-147、B15-84、B15-148、B15-1507草莓华阳镇2015B15-111、B15-113、B15-134、B15-139、B15-151、B15-152、B15-158、B15-176、B15-179、B15-187、B15-188、B15-189、B15-112、B15-116、B15-121、B15-123、B15-124、B15-125、B15-133、B15-137、B15-140、B15-156、B15-157、B15-159、B15-160、B15-180、B15-181、B15-190、B15-19429草莓白兔镇2015

1.3 灰霉病菌对啶酰菌胺抗药性的检测

采用区分剂量法测定啶酰菌胺浓度为1 mg/L[15]时，灰霉病菌孢子的萌发生长是否正常。培养基为YBA培养基，制作药皿，设不加药剂的空白为对照。具体方法如下：事先培养病原菌并确保长出分生孢子，用灭菌牙签蘸取事先培养好的病菌孢子，点在药皿上，23 ℃培养72 h后观察。平板上病菌孢子正常萌发且菌丝正常生长的确定为抗性菌株，不能正常生长的确定为敏感菌株，重复2次。

1.4 灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性测定

采用孢子萌发法，挑取9株敏感菌株(事先在PDA平板上活化培养7 d)，用无菌水清洗灰霉孢子，稀释到1 ml 1×106个，取100 μl加入到含啶酰菌胺系列质量浓度(0.003 mg/L、0.010 mg/L、0.030 mg/L、0.100 mg/L、0.300 mg/L和1.000 mg/L)的YBA平板表面，用三角涂布棒涂抹均匀。同样方法测定抗性菌株的敏感性，所不同的是药剂质量浓度设为0.100 mg/L、0.300 mg/L、1.000 mg/L、3.000 mg/L、10.000 mg/L和30.000 mg/L，以不含药剂的平板为对照，每个处理重复4次，23 ℃培养20 h后镜检。采用五点取样法，量取一个视野中各孢子萌发的芽管长度，计算平均值，与对照比较，计算抑菌率。利用DPS软件，通过浓度对数值(x)与抑制率几率值(y)之间的线性回归关系，求出毒力回归方程和有效抑制中浓度(EC50)，根据各菌株的EC50值求得抗性菌株抗性因子的RF值(抗性菌株EC50/敏感菌株EC50)。菌株敏感性表型按RF值大小划分如下：敏感菌株(RF<2，S)、敏感性下降菌株(2≤RF<3，RS)、低抗菌株(3≤RF<10，LR)、中抗菌株(10≤RF<100，MR)和高抗菌株(RF≥100，HR)[16]。

1.5 抗药性分子机制

选取9株敏感菌株和所有抗性菌株，按DNA试剂盒(OMEGA)法提取基因组DNA。引物序列：IpBcBeg(5′-CCACTCCTCCATAATGGCTGCTCTCCGC-3′)+IpBcEnd2(5′-CTCATCAAGCCCCCTCATTGATATC-3′)[17]。采用50 μl反应体系，95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共进行35个循环，最后68 ℃延伸4 min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由南京金斯瑞生物科技有限公司进行产物纯化和序列测定。抗性靶标基因序列比对分析用NCBI中的BLAST软件进行，序列编辑用DNASRAR软件进行。

2 结果与分析

2.1 灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性

在含有1 mg/L啶酰菌胺的YBA平板上，灰霉病菌孢子正常萌发生长的判定为抗性菌株，不能正常萌发生长的菌株判定为敏感菌株。供测的122株菌株中，抗性菌株52株(42.6%)，敏感菌株70株(57.4%)。其中葡萄灰霉病菌抗性菌株31株，占所有葡萄灰霉病菌菌株的53.85%，草莓灰霉病菌抗性菌株21株，占所有草莓灰霉病菌菌株的32.86%。由此可见，本地区灰霉病菌种群中已形成了抗啶酰菌胺的稳定种群。从取样作物来看，葡萄果实上取样的灰霉病菌种群抗性频率远大于草莓果实上取样的灰霉病菌种群。从地区分布来看，不同地区用药水平不同，抗性频率亦不同，葡萄和草莓主产区白兔镇所采集的样品对啶酰菌胺的抗性频率最高(53.42%)，其次为石狮镇(41.67%)、华阳镇(40%)、茅山镇(16.67%)，在新兴草莓种植地区(天王镇和后白镇)的样品中没有检测到抗性菌株(图1)。

图1 灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性Fig.1 Percentage of resistant isolates of Botrytis cinerea collected from different sites

2.2 灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性表型

9株对啶酰菌胺敏感的灰霉病菌菌株EC50平均值为0.035 3 mg/L，其中8株敏感菌株的EC50值小于0.100 0 mg/L(88.89%)(图2A)。抗性菌株EC50值主要集中在0.500 1～2.000 0 mg/L(79.17%)(图2B)。根据抗性菌株与敏感菌株EC50比值(RF)的大小，可将菌株的敏感性表型进行划分。本研究中敏感性表型S(8株)、RS(1株)、LR(8株)、MR(42株)和HR(2株)菌株的EC50平均值分别为0.044 8 mg/L、0.131 7 mg/L、0.326 1 mg/L、1.255 5 mg/L和11.170 7 mg/L(图3A、图3B)。

A：敏感菌株；B：抗性菌株。图2 灰霉病菌对啶酰菌胺的EC50分布频率Fig.2 Effective concentration resulting in 50% mycelial growth inhibition(EC50) for nine boscalid-sensitive isolates(A) and 52 boscalid-resistant isolates(B) of B. cinerea

A：敏感菌株；B：抗性菌株。图3 灰霉病菌对啶酰菌胺的RF值分布频率Fig.3 Resistance factors(RF) for nine boscalid-sensitive isolates(A) and 52 boscalid-resistant isolates(B) of B. cinerea

2.3 灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性分子机理

对9株敏感菌株和所有抗性菌株的抗性靶标基因(sdhB、sdhC和sdhD)进行测序分析，结果(表2)表明，敏感菌株sdhB、sdhC和sdhD3个亚基上均未发现氨基酸的取代，与敏感菌株相比，27株葡萄灰霉病菌抗性菌株和21株草莓灰霉病菌抗性菌株sdhB基因第272位密码子由CAC(编码组氨酸，H)突变成为CGC(编码精氨酸，R)，即H272R突变。1株葡萄灰霉病菌抗性菌株sdhB基因第272位密码子由CAC(编码组氨酸，H)突变成为CGT(编码精氨酸，R)，即H272R突变。3株葡萄灰霉病菌抗性菌株sdhB基因第272位密码子由CAC(编码组氨酸，H)突变成为TAC(编码酪氨酸，Y)，即H272Y突变，未检测到在sdhC和sdhD亚基上发生突变的抗性菌株。

3 讨 论

琥珀酸脱氨酶抑制剂包括啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等23种药剂[18]，是目前较为畅销的杀菌剂。该类药剂的作用位点在线粒体呼吸链细胞色素b560的琥珀酸脱氢酶(琥珀酸泛醌氧化还原酶)复合体II亚基上(该酶复合体是线粒体电子传递通路和三羧酸循环的重要组成部分，催化琥珀酸氧化为延胡索酸以及醌的还原)，并阻碍细胞能量和细胞基本组成物质的产生，干扰细胞的分裂和生长，SDHIs类药剂与现有其他种类药剂间不存在交互抗性[19]。

表2灰霉病菌sdhB基因突变及敏感性表型检测结果

Table2MutationsinsubunitsdhBandcorrespondingphenotypesofB.cinereaisolates

菌株号菌株数EC50作物敏感性表型sdhB突变位点RF值B15-8、B15-9、B15-10、B15-14、B15-53、B15-64、B15-124、B15-18080.0448草莓S--B15-2610.1317草莓RS--PTB16-9、PTB16-21、PTB16-6930.3031葡萄LRH272R4.03～7.78B15-134、B15-189、B15-194、B15-251、B15-25450.3400草莓LRH272R2.63～9.51B15-11、B15-39、B15-60、B15-78、B15-113、B15-137、B15-147、B15-151、B15-158、B15-160、B15-188、B15-216、B15-225、B15-250141.0942草莓MRH272R10.18～35.14PTB16-5、PTB16-8、PTB16-11、PTB16-12、PTB16-14、PTB16-15、PTB16-18、PTB16-19、PTB16-20、PTB16-26、PTB16-28、PTB16-31、PTB16-35、PTB16-39、PTB16-70、PTB16-71、PTB16-72、PTB16-75、PTB16-79、PTB16-81、PTB16-83、PTB16-86、PTB16-87、PTB16-89、PTB16-109251.3220葡萄MRH272R10.06～77.65B15-225、B15-239211.1707草莓HRH272R151.43～259.15PTB16-73、PTB16-78、PTB16-8231.4552葡萄MRH272Y26.27

-：未检测到突变；S：敏感；RS：敏感性下降；LR：低抗；MR：中抗；HR：高抗。

江苏丘陵句容地区采用啶酰菌胺防治灰霉病已超8年，近几年拜耳公司研制的氟吡菌酰胺和肟菌酯的复配制剂(露娜森)也开始在草莓上使用。随着使用时间和频次的增加，病菌对啶酰菌胺的抗药性也逐渐显露。鉴于此，本研究在2015年和2016年采集不同作物(草莓、葡萄)灰霉病菌，采用区分计量法测定其抗药性水平，发现本地区啶酰菌胺抗性菌株频率均值已达42.60%，但不同地区不同作物抗药性频率间存在显著差异。句容市天王镇和后白镇均未发现抗性菌株，主要是因为这2个乡镇草莓和葡萄的种植时间较短，而白兔镇、石狮镇和华阳镇草莓种植已有20多年，检测到灰霉病菌种群的抗药性频率较高，分别达53.42%、41.67%和40.00%。此外，葡萄果实灰霉病菌种群的抗性菌株频率还略高于草莓果实灰霉病菌种群，这是因为啶酰菌胺是葡萄灰霉病防治的主打药剂。以上结果充分说明，在草莓和葡萄园里灰霉病菌抗啶酰菌胺种群已经稳定存在。

灰霉病菌对啶酰菌胺敏感性的测定结果表明，本地区灰霉病菌对啶酰菌胺的抗药性以中抗菌株为主。对所有抗性菌株靶标基因(sdhB、sdhC和sdhD)进行测序分析，结果表明，所有抗性菌株的突变都只发生在sdhB基因的第272位，且只发现H272R和H272Y 2种突变类型。以上研究结果与Veloukas等[16]报道的结果相似，所不同的是本研究中未检测到H272L、P225F和N230I等突变类型。综上所述，灰霉病菌sdhB基因不同的突变类型与药剂敏感性之间有相关性。

有研究将灰霉病菌sdhB基因突变中H272L和P225F类型的菌株用于草莓果实离体防治试验中，啶酰菌胺对其失去防效[16]，鉴于此，为了及时提供抗药性信息，需持续监测本地灰霉病菌种群对啶酰菌胺抗药性的动态变化，特别是明确是否还有其他新的突变类型。

在室内培养条件下，灰霉病菌敏感菌株和抗性菌株对温度的敏感性、菌丝生长速度、产孢能力和孢子萌发能力等无显著差异[18,20]。在田间条件下，用杀菌剂防治灰霉病菌利于抗性菌株获得有利的选择优势，在持续的药剂选择压力下，抗性菌群会逐渐成为主导种群。因此，利用抗药性监测的结果，因地制宜指导各地农户合理使用不同作用机制的农药，不但能有效遏制植物病原菌抗性种群的发展，延长药剂的使用寿命，还能为各地农药的减量使用提供理论依据。

[1] LI Q, YAN L Y, TONG Y F, et al. Occurrence of iprodione-resistantBotrytiscinereastrain from strawberry in Zhejiang and possible molecular mechanism[J]. Journal of Fruit Science, 2007, 24: 344-348.

[2] 刘 波，刘经芬，叶钟音，等. 药剂诱导灰葡萄孢产生速克灵抗性菌株的研究[J]．植物病理学报，1993，23(1): 79-80.

[3] 焦子伟，孙清花，张 娜，等．新疆伊犁温室有机番茄病虫害发生及综合防治[J]．江苏农业科学，2017，45(10)：77-80.

[4] 亦 冰. 新颖杀菌剂—啶酰菌胺[J]. 世界农药, 2006, 28(5): 51-53.

[5] AVENOT H F, SELLAM A, KARAOGLANIDIS G, et al. Characterization of mutations in the iron-sulphur subunit of succinate dehydrogenase correlating with boscalid resistance inAlternariaalternatefrom California pistachio[J]. Phytopathology, 2008, 98(6): 736-742.

[6] AVENOT H, SELLAM A, MICHAILIDES T. Characterization of mutations in the membrane-anchored subunits AaSDHC and AaSDHD of succinate dehydrogenase fromAlternariaalternataisolates conferring field resistance to the fungicide boscalid[J]. Plant Pathology, 2009, 58(6):1134-1143.

[7] ITO Y, MURAGUCHI H, SESHIME Y, et al. Flutolanil and carboxin resistance inCoprinuscinereusconferred by a mutation in the cytochrome b560subunit of succinate dehydrogenase complex (complex II) [J]. Molecular Genetics and Genomics, 2004, 272(3): 328-335.

[8] KEON J P R, WHITE G A, HARGREAVES J A. Isolation, characterization and sequence of a gene conferring resistance to the systemic fungicide carboxin from the maize smut pathogen,Ustilagomaydis[J]. Current Genetics, 1991, 19(6): 475-481.

[9] MIYAMOTO T, ISHII H, STAMMLER G, et al. Distribution and molecular characterization ofCorynesporacassiicolaisolates resistant to boscalid[J]. Plant Pathology, 2010, 59(5):873-881.

[10] STAMMLER G, BRIX H D, GLTTLI A, et al. Biological properties of the carboxamide boscalid including recent studies on its mode of action[M]. Alton: British Crop Protection Council Publications, 2007: 40-45.

[11] LEROUX P, GREDT M, LEROCH M, et al. Exploring mechanisms of resistance to respiratory inhibitors in field strains ofBotrytiscinerea, the causal agent of gray mold[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(19): 6615-6630.

[12] MATSSON M, HEDERSTEDT L. The carboxin-binding site onParacoccusdenitrificans succinate: quinone reductase identified by mutations[J]. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2001, 33(2): 99-105.

[13] STAMMLER G, BRIX H D, NAVE B, et al. Studies on the biological performance of boscalid and its mode of action[M]. Friedrichroda：Deutsche Phytomedizinische Gesellschaft, 2008:45-51.

[14] VELOUKAS T, LEROCH M, HAHN M, et al. Detection and molecular characterization of boscalid-resistantBotrytiscinereaisolates from strawberry[J]. Plant Disease, 2011, 95(10):1302-1307.

[15] LATORRE B A, TORRES R. Prevalence of isolates ofBotrytiscinerearesistant to multiple fungicides in Chilean vineyards[J]. Crop Protection, 2012, 40: 49-52.

[16] VELOUKAS T, MARKOGLOU A N, KARAOGLANIDIS G S. Differential effect ofsdhBgene mutations on the sensitivity to SDHI fungicides inBotrytiscinerea[J]. Plant Disease, 2013, 97(1): 118-122.

[17] HU M J, FERNNDEZ-ORTUO D, SCHNABEL G. Monitoring resistance to SDHI fungicides inBotrytiscinereafrom strawberry fields[J]. Plant Disease, 2016, 100(5): 959-965.

[18] 李良孔，袁善奎，潘洪玉，等. 琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)杀菌剂及其抗性研究进展[J]. 农药, 2011, 50(3)：165-169.

[19] 颜范勇,刘冬青,司马利锋,等. 新型烟酰胺类杀菌剂—啶酰菌胺[J]. 农药, 2008, 47(2):132-135.

[20] 尹大芳. 浙江省草莓灰霉病菌抗药性检测及抗性机制的研究[D]. 杭州：浙江大学, 2015.