猪流行性腹泻病毒HB2015分离株N基因表达及单克隆抗体的制备

祁光宇， 刘 斌， 赵兴绪

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070； 2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度传播性的猪特别是仔猪肠道疾病，以猪急性肠炎、水样腹泻、呕吐和严重脱水为主要特征[1-2]。中国在2010年PEDV出现新的变异株[3]。这些新变异株造成较高的新生仔猪和哺乳猪发病率和死亡率[4]。PEDV感染不但给养猪业造成巨大经济损失，并且导致国内猪肉价格上涨。

PEDV 基因组为单股正链 RNA，整个基因组长约为 28 Kb，编码的必须结构蛋白质有4种，分别为突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)[5-6]。PEDV的核心部分是N蛋白与基因组RNA结合形成的螺旋状核蛋白体。N蛋白是PEDV已知结构蛋白中唯一的磷酸化蛋白，也是组成病毒核衣壳的结构基础。除此之外，N蛋白还具有保守性强的特点，而猪在感染PEDV的早期，体内就能产生高水平的抗N蛋白抗体。因而利用N蛋白建立PEDV分子生物学诊断技术具有很好的应用前景[7]。猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎、轮状病毒病和细菌性腹泻等从临床症状上很难区分[8]，必须进行实验室检测才能确诊。目前，检测猪流行性腹泻病毒的主要方法有反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等[9-10]，这些方法费时费力，所以快速、准确的实验室诊断方法对于猪流行性腹泻的监测和防控具有重要意义。本研究以原核表达的N蛋白为基础制备单克隆抗体，以期为进一步研制猪流行性腹泻病快速诊断方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和主要试剂

猪流行性腹泻病毒B2015株由中农威特研发中心分离保存。载体pET-32a(+)由本实验室保存。T-Vector pMDTM19 (Simple)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa Ex Taq©试剂盒、限制性内切酶为宝日医生物技术有限公司产品，One Step RT-PCR Kit、Gel Extraction Kit D2500琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂、Viral RNA Kit为OMEGA公司产品，克隆DH5α感受态细胞、表达BL21(DE3) 感受态细胞、HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗鼠IgG、DMEM培养基、胎牛血清为全式金公司产品，His-trap HP型镍离子亲和层析柱为GE公司产品。其他常规试剂为国产分析纯。

1.2 引物设计与合成

根据国内近几年猪流行性腹泻病毒株，参考GenBank中KX016034.1全基因组序列设计1对特异引物扩增N基因。根据载体酶切位点的要求，引物分别加入BamH Ⅰ和XhoⅠ位点，引物NF序列为5′-AACGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCA-3′，，NR为5′-AGACTCGAGTTAATTTCCTGTATCGAAG-3′。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.3 病毒总RNA提取与One Step RT-PCR扩增

按照Viral RNA Kit试剂盒说明书提取猪流行性腹泻病毒B2015株的基因组RNA。以提取的RNA为模板，采用RT-PCR扩增N基因。反应体系: 5×Reaction buffer 10 μl，Template RNA 10 μl，Sense primer (10 μmol/L) 1 μl，Anti-sense primer (10 μmol/L) 1 μl，M-MLV RTase/TaqDNA Polymerase Mix 1 μl，Nuclease-free water 271 μl。反应程序：42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环,最后72 ℃延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。

1.4 表达载体的构建与鉴定

将回收产物连接至T-Vector pMDTM19 (Simple)载体上，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃过夜培养后挑取单菌落接种至含100 μg/ml 氨苄青霉素(Amp+)的LB液体培养基中增殖培养，提取重组质粒进行鉴定和测序。将测序正确的重组质粒pMDTM19-N和质粒pET32a(+)用BamHⅠ和XhoⅠ两种内切酶进行酶切，对两种酶切产物进行切胶回收后，使用T4 DNA ligase分别连接同样经酶切后的质粒pET32a(+)和质粒pMDTM19-N，16 ℃连接过夜。将连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于Amp+LB固体培养基平板中，培养板倒置于37 ℃培养箱中过夜培养。挑取单菌落至Amp+LB液体培养基中增殖培养，提取质粒进行酶切和PCR鉴定、测序。质粒测序由宝日医生物技术有限公司进行。

1.5 重组N蛋白的表达、鉴定及纯化

将测序正确的重组质粒pET32a-N转化至大肠杆菌BL21(DE3) Chemically Competent Cell感受态细胞，并涂布于Amp+LB平板中，挑取单菌落至Amp+LB液体培养基中培养活化，加入终浓度为1 mmol/L IPTG在37 ℃条件下诱导表达5 h。将不同时间收集的菌液12 000 r/min离心5 min，弃上清。沉淀用50 μl PBS重悬后加等量的2×SDS凝胶上样缓冲液，沸水煮10 min后进行SDS-PAGE电泳检测。

1.6 表达蛋白纯化及动物免疫

将大量表达的细菌沉淀用Binding Buffer重悬并用超声波裂解菌体，离心取上清部分，参照His-trap HP型镍离子亲和层析柱说明书纯化蛋白质。将所得蛋白质免疫6周龄BALB/c小鼠，同时做空白对照，在融合前3 d每只小鼠腹腔注射200 μg进行加强免疫。

1.7 PEDV-N蛋白单抗的制备

小鼠尾静脉取血，用ELISA方法测定各小鼠血清效价，效价高于1∶10 000的鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按聚乙二醇(PEG)方法进行杂交融合。用间接ELISA对杂交瘤细胞上清液进行筛选，阳性孔再经过3次有限稀释法进行亚克隆[11]，待阳性率达到100%时扩大培养，用于制备腹水，并保存于液氮。参照文献[12]制备腹水，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心取上清液。

1.8 单克隆抗体Western blot检测

将PEDV感染的细胞用细胞裂解液和SDS处理，进行SDS-PAGE试验，转PVDF膜后封闭。以制备的单克隆抗体反应1 h, TBST洗涤后加入HRP标记羊抗鼠IgG反应1 h, TBST洗涤后显色进行鉴定。同时设立空质粒表达的菌体蛋白为阴性对照组。

1.9 单克隆抗体的间接免疫荧光试验(IFA)检测

用PEDV感染接种于24孔细胞板的Vero细胞。培养至出现明显病变时，先用甲醛固定细胞，PBS洗涤之后加入PBSA封闭1 h。PBS洗涤后加入制备的单克隆抗体反应1 h，PBS洗涤干净，并加入绿色荧光二抗反应1 h，洗涤干净后进行荧光观察。同时设未感染的细胞作空白对照。

2 结 果

2.1 PEDV N基因重组表达质粒pET-32a-N的鉴定

对重组质粒pET-32a-N进行BamH I、XhoI双酶切和PCR后进行电泳，分别在约6 000 bp和1 326 bp处出现明亮的条带，与预期大小一致(图1)。测序结果显示与标准基因同源性为100%，说明已成功构建了猪流行性腹泻病毒N基因原核表达载体pET-32a-N。

M：DNA标准DL 8000；1：重组表达质粒pET-32a-N对照；2：pET-32a-N的Bam H I、Xho I双酶切；3：N基因的PCR产物。图1 猪流行性腹泻病毒N基因重组表达质粒pET-32a-N的鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pET-32a-N of porcine epidemic diarrhea virus N gene

2.2 重组N蛋白的诱导表达和纯化

含有重组质粒的E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE电泳分析结果显示有1条分子量约为 6.8×104大小的蛋白质条带，与预期大小一致，说明重组质粒在大肠杆菌中成功表达(图2)。将纯化后的蛋白质经SDS-PAGE电泳后，转印到NC膜上，用猪流行性腹泻阳性血清进行Western blotting鉴定。结果显示，在分子量约 6.8×104处可见特异性条带，而菌体蛋白无条带(图3)。

M：蛋白质分子质量标准；1：诱导后的pET-32a(+)空载体；2：未诱导的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重组菌；3：诱导后的pET-32a-N/E.coli BL21(DE3)重组菌。图2 重组N蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant N protein

M：蛋白质分子质量标准；1：纯化N蛋白。图3 纯化的重组N蛋白Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis of purified recombinant N protein

2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选

用ELISA方法筛选得到稳定的阳性杂交瘤细胞。将初步筛选出的阳性杂交瘤细胞再经3次亚克隆，共获得2株稳定分泌抗N蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为C5D3和H3E7,将其扩大培养后保存于液氮备用。

2.4 单克隆抗体C5D3和H3E7的Western blotting鉴定

2株单抗C5D3和H3E7均可特异性识别N蛋白，在分子量约 6.8×104处出现特异性条带，而与空质粒表达的菌体蛋白不发生反应(图4)。

M：蛋白质分子质量标准；1：C5D3株；2：H3E7株；3：阴性对照。图4 单抗C5D3和H3E7株的Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis of monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

2.5 单克隆抗体C5D3和H3E7的IFA分析

IFA检测结果显示，感染PEDV病毒的细胞出现明显绿色荧光，而对照组无荧光出现(图5)，证明这2个单抗能特异地识别和结合PEDV病毒N蛋白。

3 讨 论

中国近几年PED的发病率、死亡率均呈明显上升趋势，特别是从2010年10月以后，PED在中国广泛流行并出现新的变异株。感染 PEDV后，哺乳仔猪死亡率可达80%～100%，但繁殖母猪和公猪感染后很少表现出临床症状。PED大规模暴发的最主要原因是病毒的变异，这给PED的防控带来了新的挑战[13]。

在PEDV合成过程中，N蛋白既能与病毒RNA缠绕成为病毒粒子的核衣壳，又能结合磷脂和细胞膜，促进形成RNA复合体，对病毒组装有重要作用[5-6]。同时N蛋白的保守性很高，在猪感染早期，机体就可以产生抗N蛋白抗体，所以N蛋白可以作为早期诊断的靶蛋白，同时可以用于研制开发抗PEDV的表位疫苗[14]。

本试验通过构建PEDVN基因重组质粒pET-30a-N，然后以纯化后的PEDV-N蛋白为免疫原免疫小鼠，成功制备了2株抗PEDV的单克隆抗体。经ELISA和IFA方法检验，制备的单抗均能与PEDV N蛋白和PEDV结合。在试验过程中，发现对杂交瘤细胞系定期克隆化检测抗体水平是很有必要的，其目的是防止杂交瘤细胞在长期传代过程中丧失分泌抗体的功能，影响后续试验的进行。对杂交瘤细胞稳定性分析结果显示，2株单抗分泌能力稳定性良好，未出现急性下降甚至消失的情况。在制备腹水过程中发现，C5D3株单抗细胞产生腹水量很少，H3E7株细胞产生的腹水量比较多。其中腹水量少的原因：一是于注射石蜡后7 d就注射细胞，时间过早；二是细胞量过多也会引起腹水过少或不出现，出现实体瘤现象[14]。

A：C5D3株；B：H3E7株；C：阴性对照。 图5 单克隆抗体C5D3和H3E7与感染PEDV的Vero 细胞IFA 试验Fig.5 The indirect immunofluorescence assay (IFA) of PEDV in Vero cells with monoclonal antibody of C5D3 and H3E7

快速、准确以及操作简单易行的诊断方法是有效防控疫病的基础和前提条件。近年来在PED诊断方法上取得了很大进展，目前已经有很多新技术应用于PED的诊断,比如ELISA、RT-PCR和免疫荧光技术[15]。虽然这些检测方法准确率较高，但所需试剂繁多、经济成本高，且有设备和技术要求，难以在基层推广普及[16]。胶体金免疫层析法(GICA)是近些年发展起来的一种以抗原抗体特异性反应为基础的新型免疫检测技术，可以弥补仪器检测方法的不足，在现场检测方面具有广阔的应用前景[17]。本试验成功制备并鉴定了抗PEDV-N蛋白单克隆抗体，为猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立奠定了坚实基础。

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