绵羊肺炎支原体P208蛋白质的分子特征分析及免疫原性

管礼麟， 马 媛， 杨丹茹， 杨发龙

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae)是引起绵羊、山羊以及小反刍野生动物非典型肺炎的重要病原[1-4]。此外，羊感染绵羊肺炎支原体后，对其他病原的易感性增加[5]。该病原在世界多个国家及地区均有分布，在中国多个地区流行也十分广泛，给养羊业带来较大的经济损失[6-8]。

研究结果表明，绵羊肺炎支原体与引起猪地方流行性肺炎的病原猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae， Mhp)具有最为相近的亲缘关系[9-10]。目前对猪肺炎支原体的毒力因子及重要功能蛋白进行了较为深入的研究，特别是黏附相关分子和免疫原蛋白[11-12]。其中由mhp493基因(p216基因)编码的P216蛋白，不仅参与猪肺炎支原体对细胞的黏附，也证明是重要的免疫原之一，可诱导机体产生抗体[13-14]。在对绵羊肺炎支原体SC01全基因组[14]进行分析的过程中，发现1个与猪肺炎支原体p216高度同源的基因，其编码蛋白的分子量预测为208 400，故暂命名为p208基因，编码蛋白命名为P208蛋白。但目前对该蛋白分子特征以及免疫原特性尚不清楚。因此本研究对p208基因序列进行生物信息学分析，对其进行原核表达，并分析其免疫原性，旨在为下一步深入研究其结构及功能以及为其在亚单位疫苗和血清学诊断中作为抗原的可能性提供依据。

1 材料及方法

1.1 菌株、载体及血清

绵羊肺炎支原体SC01株由西南民族大学动物医学实验室分离鉴定和保存。pET-32a(+)载体为Novagen公司产品。大肠杆菌E.coilDH5α、BL21(DE3)感受态细胞均购自北京天恩泽基因科技有限公司。山羊抗绵羊肺炎支原体SC01株阳性血清由本实验室制备。HRP标记的兔抗山羊IgG购自Abbkine公司。

1.2 主要试剂

限制性内切酶BamH I、XhoI和T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。金牌 Mix(green) Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1x)为北京擎科新业生物技术有限公司产品。Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit均为Omega公司产品。HistrapTM蛋白纯化柱为GE Healthcare公司产品。SuperLumia ECL HRP Substrate Kit为Abbkine公司产品。

1.3 p208基因序列分析

采用NCBI的BLAST工具及DNAStar软件进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较和分析,同时进行核苷酸和氨基酸的比对及分析。采用TMHMM、SignalP4.1、LipoP1.0等在线软件对P208蛋白的跨膜区、信号肽、脂蛋白及抗原性及理化性质进行分析。

1.4 引物设计

根据绵羊肺炎支原体SC01株p208基因序列(Accession: AFHO01000009.1)，采用Primer Premier 6.0软件设计了1对引物P208F和P208R，其序列为：P208F: 5′-CGCGGATCCGAAGATGCCCTTGCCAGTCT-3′(下划线部分为BamH I酶切位点)；P208R: 5′-CCGCTCGAGCAGATGCTGAACCACCTTGGT-3′(下划线部分为XhoI酶切位点)。这对引物扩增的片段大小为676 bp(从第1 498 bp至2 173 bp)，该片段编码的P208蛋白从第500位至第725位氨基酸，该区域不含有在支原体中编码色氨酸的TGA密码子，且含有丰富的抗原表位。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 目的片段的PCR扩增

采用酚/氯仿法提取绵羊肺炎支原体SC01株基因组DNA作为PCR扩增反应中需添加的模板，利用上述引物P208F/P208R进行PCR扩增，反应总体系为20 μl，包括金牌 Mix(green) Golden Star T6 Super PCR Mix(1.1x) (5 U/μl)10 μl、上下游引物(10 U/L)各1 μl、DNA模板2 μl以及双蒸水6 μl。反应条件为：首先94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性45 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存并结束反应。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 原核表达载体的构建

采用Gel Extraction Kit进行PCR产物纯化回收。分别用限制性内切酶BamH I和XhoI对纯化的目的片段和pET-32a(+)空质粒进行双酶切，对酶切产物进行纯化回收后，采用T4 DNA连接酶进行连接反应。将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞，随后均匀涂布至含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上，37 ℃恒温培养18 h。挑取阳性菌落，接种至含有100 μg/ml 氨苄青霉素的LB肉汤中，37 ℃ 160 r/min水平摇床培养过夜后离心收集菌体，采用Plasmid Miniprep Kit按试剂盒操作说明提取质粒。通过PCR扩增对质粒进行鉴定，并将阳性克隆交由上海生工生物工程有限公司进行测序确认。将重组表达载体命名为pET-32a(+)-P208。由其编码表达的重组蛋白命名为rP208。

1.7 重组蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化

将鉴定正确的阳性重组质粒pET-32a(+)-P208转化至表达工程菌E.coliBL21(DE3)中，均匀涂布于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上，37 ℃恒温培养过夜。挑取单个阳性菌落接种至含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中，37 ℃ 160 r/min水平振荡培养过夜。取500 μl培养菌液接种至50 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中，37 ℃振荡培养至OD600达到0.6后，加入0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达12 h后，随后8 000 r/min离心15 min，弃去上清液，加入适量PBS重悬菌体沉淀后，同条件再次离心，收集菌体沉淀，加入10 ml PBS重悬后，采用超声破碎仪在冰浴条件下进行超声裂解。破碎完成后8 000 r/min 4 ℃离心30 min，分别收取上清液和沉淀，沉淀加入5 ml PBS(0.01 mol/L，pH7.4)重悬。利用SDS-PAGE电泳对沉淀和上清液中的重组蛋白质进行检测，鉴定其可溶性。根据可溶性结果，使用GE公司HistrapTMHP纯化柱按照说明书对重组蛋白质rP208进行纯化。

1.8 Western blot分析

用纯化的rP208蛋白质制样，进行SDS-PAGE电泳，利用半干转印仪转移至PVDF膜上。50 g/L脱脂奶粉溶液封闭过夜，TBST洗涤3次(每次10 min)后以1∶100稀释的山羊抗绵羊肺炎支原体SC01株阳性血清为一抗孵育2 h，同法洗涤后孵育二抗2 h，二抗为1∶10 000稀释的HRP标记的兔抗山羊IgG，最后洗涤完毕后，加入SuperLumia ECL HRP Substrate Kit发光剂，于Versa Doc成像系统成像。以绵羊肺炎支原体抗体阴性的山羊血清作为对照。

2 结 果

2.1 p208基因及其编码蛋白质的分子特征分析

2.1.1 同源性分析 经BLAST比较分析，绵羊肺炎支原体p208基因仅与猪肺炎支原体p216(GenBank: AF541877.1)、编码殊异支原体细胞表面蛋白基因(MDIS-02775)(GenBank:CP007229.1)以及编码猪絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因(MYF-00960)(GenBank: CP007585.1)之间具有较高的相似性。经DNAStar软件进行比对分析(表1)发现，绵羊肺炎支原体p208基因与编码殊异支原体细胞表面蛋白基因相似性最高，两者核苷酸序列相似性为58.6%，与猪肺炎支原体p216基因及编码猪絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因核苷酸序列相似性均为56.2%，。因此可推测上述4个基因为直系同源基因。

2.1.2 蛋白质理化性质分析 P208蛋白的相对分子质量为208 401，理论等电点为5.5。原子总数为29 158，原子组成为C: 9 249；H: 14 513；N: 2 457；O: 2 911；S: 11；Se: 17，分子式为C9249H14513N2457O2911S11Se17。其中，Ser(9.7%)、Leu(9.3%)、Lys(8.1%)、Asp(7.3%)、Gln(7.0%)、Asn(7.0%)等含量较高，而Seu(0.9%)、Met(0.6%)、Trp(0.3%)等含量相对较低。不稳定系数为39.61，是一个稳定蛋白质。

表1p208核苷酸同源性分析

Table1Thehomologyanalysisofp208nucleotide

基因1234165.258.664.9256.265.7356.24

1:编码殊异支原体细胞表面蛋白基因MDIS-02775；2：猪肺炎支原体p216；3：绵羊肺炎支原体p208；4：编码猪絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因MYF-00960。

2.1.3 跨膜区及信号肽分析 根据P208蛋白的蛋白质信号肽的分析以及蛋白质跨膜结构的预测结果(图1)分析可知，P208蛋白不含脂蛋白信号肽成分，其氨基酸序列中第1～18个氨基酸位于细胞膜内部，第19～41个氨基酸间形成1个明显的跨膜螺旋结构区域，第42～1 853氨基酸则位于细胞膜外侧，即P208蛋白主要位于细胞膜外侧。

图1 P208蛋白跨膜区分布Fig.1 Transmembrane region distribution of P208 protein

2.1.4 抗原表位分析 在线分析抗原表位，结果(图2)表明，P208蛋白可能含有69个抗原表位，平均抗原趋向性为1.020 8，其中第 157～180位氨基酸形成的表位抗原指数最高，其氨基酸序列为TKSIYLSVVDAPKAALAQFSDIVD。

图2 P208蛋白抗原表位分布Fig.2 Antigenic epitopes distribution of P208 protein

2.2 p208基因片段的PCR扩增

使用特异性引物P208F/P208R,以绵羊肺炎支原体SC01株DNA作为模板进行PCR扩增后，经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，在700 bp左右出现了特异性条带，该片段与预期中目的条带的大小(676 bp)相符，阴性对照没有出现扩增(图3)。

M:DNA markerⅡ；1： 绵羊肺炎支原体SC01株基因组DNA；2: 阴性对照。图3 p208基因片段的PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification of p208 fragment

2.3 原核表达载体的构建及鉴定

PCR产物连接至pET-32a(+)载体，转化至大肠杆菌E.coilDH5α感受态细胞，筛选得到阳性克隆后，以提取的重组质粒为模板，采用P208F/P208R进行PCR扩增，所得条带与预期相符(图4)。对PCR鉴定为阳性的质粒进行测序，结果表明，目的片段的序列及大小与绵羊肺炎支原体SC01株p208基因相应区域完全相同。

M：DNA markerⅡ；1：绵羊肺炎支原体SC01株基因组DNA；2～5：重组质粒；6：阴性对照。图4 重组质粒的PCR鉴定Fig.4 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4 重组蛋白的表达、可溶性分析及纯化

将重组质粒pET-32a(+)-p208转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达，在不同时间点收集菌体进行SDS-PAGE检测，结果显示，重组表达工程菌经IPTG诱导后，表达蛋白的条带大小与预期(36 500)相符，表明目的片段以融合蛋白质的形式得到了表达。

为分析重组蛋白质的可溶性，分别对全菌裂解物上清液及沉淀进行SDS-PAGE分析，结果显示，表达的重组蛋白质主要存在于上清液中，表明该蛋白质以可溶性形式进行表达。利用HistrapTMHP纯化柱对重组P208蛋白进行纯化，经SDS-PAGE电泳，结果可知，在36 500左右处出现明显条带(图5)，说明纯化效果良好。

M: 蛋白分子量标准；1：上清液；2：沉淀；3：纯化产物。图5 表达产物的可溶性分析及纯化Fig.5 Solubility analysis and purification of rP208

2.5 重组蛋白Western-blot分析

以纯化P208蛋白制样，进行SDS-PAGE电泳，转膜后，利用山羊抗绵羊肺炎支原体高免血清为一抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG为二抗进行Western-blot分析。结果(图6)表明，经纯化后的重组蛋白与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌抗体结合。表明P208蛋白具有良好的免疫原性。

M：蛋白分子量标准；1：纯化的重组蛋白rP208+阳性血清；2：纯化的重组蛋白rP208+阴性血清。图6 P208纯化重组蛋白的Western-blot分析Fig.6 Western-blot analysis of P208 purified recombinant protein

3 讨 论

绵羊肺炎支原体作为感染小反刍动物的呼吸道病原，随着养羊业从传统的放养向集约化、规模化的圈养等饲养方式的转变，其危害越来越严重。但是，对于该病原的致病机制、毒力因子的研究相对较少，而且也没有在临床上普遍使用的血清学诊断试剂和疫苗。因此，深入研究该病原的分子生物学特征，对于揭示其致病机制以及开发诊断试剂和疫苗均非常重要。

黏附素是支原体重要的毒力因子，同时也往往是良好的免疫原分子。在绵羊肺炎支原体中，目前尚无确定的黏附素蛋白。在我们前期的研究中，在对绵羊肺炎支原体全基因组进行测序的基础上，对可能的黏附素分子进行了预测[15]，并对P113[16-17]，P109[18]，P128[19]，P108[20]等的分子特征和免疫原性进行了研究。为进一步丰富对绵羊肺炎支原体黏附分子及免疫原蛋白的认识，本研究对绵羊肺炎支原体P208蛋白的生物信息学进行了分析。同源性比较分析发现，p208基因与猪肺炎支原体黏附素p216基因、编码殊异支原体细胞表面蛋白基因以及编码猪絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因具有较高的同源性。其中针对殊异支原体细胞表面蛋白及猪絮状支原体P97/LPPS家族蛋白的免疫原功能无相关研究报道,而针对猪肺炎支原体P216蛋白，研究结果表明其不仅参与猪肺炎支原体的黏附过程，同时也可以在体内得到表达[21]，诱导机体产生抗体，是一个良好的免疫原。

因此这提示绵羊肺炎支原体p208编码蛋白也可能是一个良好的免疫原且可能参与黏附过程。为了研究该蛋白的功能，本研究通过对编码绵羊肺炎支原体P208蛋白的部分基因片段进行了克隆，并成功在大肠杆菌中以可溶性蛋白的形式得到大量表达。利用山羊抗绵羊肺炎支原体全菌抗体进行Western-blot分析，结果表明纯化后的重组蛋白能与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌抗体特异性结合，说明P208蛋白具有免疫原性，是绵羊肺炎支原体良好的免疫原之一。这同时也说明本研究所表达的重组蛋白可以作为抗原，在亚单位疫苗开发以及ELISA等绵羊肺炎支原体血清抗体检测试剂盒的研制方面具有潜在的应用价值。但是P208蛋白是否参与绵羊肺炎支原体的黏附过程尚不清楚，有待进一步的研究。

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