AMH及其相关基因在鸭不同等级卵泡中的表达

陈 蓉， 应诗家， 陈 哲， 于建宁， 施振旦

(江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014)

抗缪勒氏管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)，又称缪勒氏管抑制物质(Mullerian-inhibiting substance，MIS)，是转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)超家族成员[1]，在性腺组织中表达。最初，人们对AMH的理解仅限于其在性别分化中的作用——抑制雄性胚胎缪勒氏管的发育[2]。直到1999年，Durlinger等通过AMH基因敲除小鼠研究发现AMH具有抑制原始卵泡募集和降低生长卵泡对促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)敏感性的作用[3-4]。体外研究结果已表明，AMH抑制生长卵泡对FSH敏感性是通过调控FSH受体(FSH receptor，FSHR)信号通路实现的[5-6]。与其他TGFβ超家族成员一样，AMH通过与细胞膜上的2个丝氨酸/苏氨酸激酶受体(Ⅰ和Ⅱ型)相结合，激活胞浆内Smad分子从而调控靶基因的转录[7]。其中，Ⅱ型受体(AMH receptor 2，AMHR2)是AMH特异性的[8]，Ⅰ型受体则与TGFβ超家族另一个成员骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)共享[9]。与哺乳动物相比，AMH基因在禽类卵泡发育中的功能研究起步较晚，目前主要集中在家鸡中。2008年，Johnson等[10]首次检测了产蛋鸡卵巢不同等级卵泡的颗粒细胞中AMH基因的表达情况，发现AMH基因的信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid，mRNA)表达量随着卵泡的发育逐渐降低，并且AMH主要由小卵泡的颗粒细胞表达，与哺乳动物的表达模式相一致，表明AMH基因在禽类中具有保守的生物学功能。目前，国内外尚无AMH基因在水禽卵泡发育中的功能研究。本研究拟以连城白鸭为研究对象，通过定量PCR技术检测卵巢不同等级卵泡中AMH基因及其相关调控基因的表达情况，为水禽卵泡发育的分子机制研究积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 样本采集

选择同批出雏同条件饲养的200日龄连城白鸭雌性个体8只，分别采集卵巢组织中的等级卵泡F5(最小的等级卵泡)、小黄卵泡(Small yellow follicle，SYF)和大白卵泡(Large white follicle，LWF)，经液氮速冻后置于-80 ℃保存。其中，等级卵泡F5去除卵黄蛋白。

1.2 总RNA提取与cDNA第一链的合成

采用动物组织总RNA提取试剂盒[DP431，天根生化科技(北京)有限公司产品]提取总RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度(OD260/OD280≥1.8；OD260/OD230≥1.0)和浓度。采用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒[RR036A，日医生物技术(北京)有限公司产品]以总RNA为模板合成互补脱氧核糖核酸(Complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)第一链。

1.3 mRNA定量PCR分析

根据GenBank中绿头鸭或者近缘物种相关mRNA序列设计基因特异性引物，引物信息见表1，其中SF1(Steroidogenic factor 1，类固醇生成因子1)、WT1(Wilms tumor 1，Wilms肿瘤基因1)、GATA4(GATA-binding protein 4，GATA结合蛋白4)基因引物序列引自参考文献[11]。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，按照TransStart Top GreenSuperMix试剂盒(AQ131-04，北京全式金生物技术有限公司产品)的说明书配制反应体系并在ABI 7500 Real-Time PCR仪上进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，每个样品重复3次。

表1定量PCR引物信息表

Table1PrimersinformationforquantitativePCR

基因名称 序列(5'→3')产物长度(bp)退火温度(℃)AMHF:CTCGGATGACAAATGCTTCA11160R:ACTCCATCAGCGGAGAGGTASOX9F:GCTGAATGAGAGCGAGAAGC11960R:CGTTCTTCACCGACTTCCTCSF1F:GCTCAGTACCTTTGGCCTCA12260R:GCAGCAGCTTCATCTGGTCTGATA4F:TTTCTGCTAACGGGAGGGAGCAAT10260R:AAGTCCAAGTGGTGGCCATTTCAGWT1F:TCTGAAGACTCATACCAGGACTCA13660R:CATGTTCCTCTGGTGCATGTAMHR2F:CTGATGGAGCACGAGAACG9060R:GTAGAGCTGCAGGACCAGGAFSHRF:CCTAGCCATTGCTGTGCATTT10660R:TGCCAGGTTGCTCATCAAGGCYP19A1F:AGAAGCGACAACAGCTTTCC12660R:TCTCCAGCACACACTGGTTCβ-actinF:GAGAAATTGTGCGTGACATCA15260R:CCTGAACCTCTCATTGCCA

1.4 总蛋白提取

将卵泡组织置于适量的组织细胞裂解液(WB-0061，北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品)中，匀浆，冰上静置至充分裂解，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，保留上清液，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白的浓度(BCA01，北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。取适量的上清液与蛋白上样缓冲液混匀，煮沸5 min，冷却至室温。

1.5 蛋白质印迹检测

总蛋白质经浓度为12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，电转印至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入鼠抗人AMH单克隆抗体(稀释比例为1∶100，sc-166752，Santa Cruz公司产品)，4 ℃孵育过夜。洗膜缓冲液(Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20，TBST)洗涤后，加入过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(稀释比例为1∶2 000，CW0103S，北京康为世纪生物科技有限公司产品)，室温孵育1 h。TBST洗涤后，加入EasySee© Western Blot Kit发光液(DW101-02，北京全式金生物技术有限公司产品)，置于ImageQuant LAS 4000化学发光成像仪中曝光，拍照。同时，使用兔抗人β-actin单克隆抗体(稀释比例为1∶1 000，Cat No. 4970，Cell Signaling Technology公司产品)进行内参蛋白的检测。

1.6 数据分析

采用2-△△Ct法进行mRNA定量PCR试验数据处理，目的基因的相对表达量采用“平均数±标准差”的形式表示。采用Image J软件对蛋白质印迹条带进行灰度值分析，目的蛋白的相对表达水平采用“平均数±标准差”的形式表示。采用SPSS软件进行统计分析，均值比较采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 AMH基因在鸭不同等级卵泡中的表达量

本研究分别通过定量PCR和蛋白质印迹技术检测了AMH基因在鸭不同等级卵泡中的表达情况。在mRNA水平上，AMH基因在大白卵泡中的表达量显著高于等级卵泡F5，在小黄卵泡中的表达量也显著高于等级卵泡F5(图1A)。在蛋白质水平上，AMH蛋白在大白卵泡中的表达量显著高于小黄卵泡和等级卵泡F5，但是在小黄卵泡中的表达量与等级卵泡F5无显著差异(图1B)。此外，AMH基因在蛋白质水平上的差异程度要低于mRNA水平。这些结果表明，随着卵泡的发育，AMH基因的表达量逐渐降低。

A：AMH基因的mRNA表达量；B：AMH蛋白的表达量。F5：等级卵泡F5；SYF：小黄卵泡；LWF：大白卵泡。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图1 鸭不同等级卵泡中AMH基因的表达量Fig.1 Expression of AMH gene in various-sized follicles of duck

2.2 AMH基因启动子区相关转录因子在鸭不同等级卵泡中的表达量

本研究通过定量PCR技术分别检测了SOX9(Sex determining region Y-box 9，SRY相关基因9)、SF1、GATA4和WT1这4种转录因子在鸭卵巢不同等级卵泡中的表达量。在mRNA水平上，SOX9基因在不同等级卵泡中的表达量无显著差异(图2A);SF1和GATA4基因在大白卵泡和小黄卵泡中的表达量显著高于等级卵泡F5(图2B和图2C)；WT1基因在大白卵泡和小黄卵泡中的表达量也显著高于等级卵泡F5(图2D)。这些结果表明，随着卵泡的发育，SF1、GATA4和WT1基因的表达量逐渐降低。

A～D：分别为SOX9、SF1、GATA4和WT1基因的mRNA表达量。F5：等级卵泡F5；SYF：小黄卵泡；LWF：大白卵泡。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2 鸭不同等级卵泡中转录因子SOX9、SF1、GATA4和WT1的表达量Fig.2 Expression of SOX9, SF1, GATA4 and WT1 in various-sized follicles of duck

2.3 AMHR2和AMH相关调控基因在鸭不同等级卵泡中的表达量

本研究通过定量PCR技术分别检测了AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6这4种基因在鸭卵巢不同等级卵泡中的表达量。在mRNA水平上，AMHR2基因在小黄卵泡的表达量显著高于等级卵泡F5(图3A)；FSHR基因在不同等级卵泡中的表达量无显著差异(图3B)；CYP19A1基因在小黄卵泡和等级卵泡F5中的表达量显著高于大白卵泡(图3C)；BMP6基因在大白卵泡和小黄卵泡中的表达量显著高于等级卵泡F5(图3D)。这些结果表明，随着卵泡的发育，CYP19A1基因的表达量逐渐升高，AMHR2和BMP6基因的表达量逐渐降低。

3 讨 论

鉴于AMH基因在哺乳动物和鸡卵泡发育中的重要作用，本研究通过定量PCR技术检测了鸭卵巢不同等级卵泡中AMH基因的表达情况。结果发现AMH基因的mRNA表达量随着卵泡的发育逐渐降低，这与Johnson等在产蛋鸡中的研究结果相一致[10]，表明AMH基因在禽类中具有保守的生物学功能。鉴于哺乳动物AMH抗体可用于检测禽类AMH蛋白表达[12]，本研究还从蛋白质水平上验证了AMH基因在卵泡发育中的表达规律。在哺乳动物中，AMH基因的起始转录需要转录因子SOX9的参与，而转录因子SF1、WT1和GATA4能够协同SOX9增强AMH基因的表达[13]。但是，Oreal等[14]在鸡胚中发现AMH基因的起始转录不需要转录因子SOX9的参与，表明AMH基因转录的调控机制在禽类与哺乳动物之间是非保守的。本研究通过定量PCR技术分别检测了这4种转录因子在鸭卵巢不同等级卵泡中的表达情况。结果发现，除了SOX9基因外，SF1、WT1和GATA4基因的mRNA表达量随着卵泡的发育逐渐降低，与AMH基因的表达趋势相一致，表明这3种转录因子可能在AMH转录调控中发挥重要作用。其中，Takada等[15]在鸡胚中已经证实SF1能够结合到AMH基因启动子区并激活其转录。因此，下一步我们需要证实WT1和GATA4是否能够结合到禽类AMH基因启动子区并激活其转录。

A～D：分别为AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6基因的mRNA表达量。F5：等级卵泡F5；SYF：小黄卵泡；LWF：大白卵泡。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图3 鸭不同等级卵泡中AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6基因的表达量Fig.3 Expression of AMHR2, FSHR, CYP19A1 and BMP6 genes in various-sized follicles of duck

在哺乳动物中的研究结果表明，AMH抑制生长卵泡对FSH敏感性是通过调控FSHR信号通路实现的。因此，本研究通过定量PCR技术分别检测了AMHR2、FSHR和CYP19A1基因的表达情况。结果发现，AMHR2基因的mRNA表达量在等级卵泡中显著降低，与AMH基因的表达趋势相似，推测AMH在卵泡发育中的重要作用是由其受体AMHR2介导的。尽管FSHR基因的表达量在不同等级卵泡间无显著差异，但是CYP19A1基因的表达量随着卵泡的发育逐渐升高，与AMH基因的表达趋势相反，推测AMH基因具有抑制FSHR信号通路的功能，而且这种作用是通过影响FSHR信号通路的下游因子来调控类固醇激素的合成实现的。在鸡中，Ocón-grove等[11]发现BMP6和AMH基因在卵泡发育中具有相似的表达模式，并且BMP6能以剂量依赖关系促进鸡等级前卵泡颗粒细胞中AMH基因的表达，表明AMH基因的表达受到卵巢局部生长因子的调控。在本研究中，我们也发现BMP6和AMH基因在鸭不同等级卵泡中的表达趋势一致，但是BMP6是否能够促进AMH基因的表达需要进一步的试验验证。

综上所述，AMH基因在鸭卵泡发育过程中发挥重要作用，其在等级前卵泡中的高表达量可能有助于维持颗粒细胞未分化的状态，且可能是通过抑制FSHR信号通路来实现的。

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