Nrf2介导姜黄素对四氯化碳诱导鲫鱼肝损伤的保护作用

张春云， 曹丽萍 , 杜金梁， 贾 睿， 顾郑琰， 殷国俊,， Galina Jeney

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214081； 2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081； 3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部鱼类免疫药理学国际联合实验室，江苏 无锡 214081； 4.Research Institute for Fisheries, Aquaculture and Irrigation, Anna light 8, Szarvas H-4440, Hungary)

近年来中国集约化水产养殖规模不断提高，但也随之产生诸多问题，如养殖密度过高、过度投喂、养殖水体污染、药物滥用、饲料营养组分不平衡等，造成鱼类病害频发，其中以肝损伤为特征的疾病尤为频繁，给水产养殖业带来极大的经济损失[1]。肝脏是鱼类物质和能量代谢的重要器官[2]，肝损伤或病变往往导致鱼类机体代谢机能紊乱和抗病力降低，甚至导致死亡。鱼类肝损伤致病因素很多，但其共同点为均伴随着严重的氧化应激，产生大量的活性氧自由基(ROS)，引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜的正常结构和功能。因此，有研究者认为可通过抑制肝组织内氧化应激或提高抗氧化能力来防治肝损伤[3]。

中草药由于其毒副作用小，不易在鱼体内富集，在水产动物病害防治中被广泛应用。已有研究结果表明，一些中草药提取物具有抗氧化作用，对鱼类肝胆综合征肝损伤有一定的治疗作用[4-5]。姜黄为常用中草药，主要来源于姜科植物姜黄(CurcumalongaL.)的干燥根茎。姜黄素为姜黄中主要药用活性成分，是一种酸性多酚类物质。在哺乳动物中，研究证实姜黄素具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗突变[8]、护肝[9-10]等功效。在水生动物中，研究发现姜黄素可促进鱼类生长，改变肠道酶活性[11-12]。

精密肝切片(Precision-cut liver slices，PCLS)技术是一种新的介于器官与细胞水平间的肝脏体外实验技术。该技术无需使用胶原酶，避免了细胞分离过程中胶原酶对细胞造成的损伤，且能够保存较完整的组织结构，维持细胞间及细胞与基质间的联系，既保留了游离肝细胞的功能特点，又维持了组织的完整性，因而能最大限度地模拟体内状态，被广泛应用于哺乳动物药理学和毒理学研究[13-15]。而在水产动物中，通过该技术研究姜黄素保肝机理的报道还未发现。

核因子NF-E2相关因子(Nuclear factor-ery throid 2-related，Nrf2)是机体对抗氧化应激最主要的调节因子[16]。正常状态下，Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)结合处于相对抑制状态。当受到氧化应激刺激时，Nrf2被激活与Keap1解离进入胞质启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化基因的表达，随后Nrf2与抗氧化反应元件(Antioxidant response element, ARE)相结合，启动下游相关抗氧化酶基因表达，使细胞抗氧化应激能力增强[17]。在小鼠中，姜黄素可抑制四氯化碳(CCl4)诱导的肝损伤并促进Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA及蛋白质表达[18-19]。在水产生物中还未见相关报道。

本研究采用PCLS技术分离鲫鱼肝组织，并进行体外培养。以CCl4诱导建立肝组织损伤模型。通过一些肝功能生化指标的变化，评价姜黄素对鲫鱼肝组织的保护作用。同时在分子水平探究Nrf2和Keap1基因在姜黄素保肝中的作用，为鱼类保肝药物的研究和开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

鲫鱼(Carassiusauratus)取自中国水产科学院淡水渔业研究中心养鱼场。大小规格为500 g左右，在25 ℃循环水中饲养7 d。

1.2 药品、试剂及仪器

姜黄素(Curcumin)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、1640培养基、链霉素和青霉素购自Sigma公司(美国)，胎牛血清(FBS)、48孔板、12孔板购于GIBCOGO公司(美国)，CCl4(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司(上海)，谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽(GSH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所科技有限公司，Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA总RNA抽提试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司(大连)。

1.3 鲫鱼肝切片的制备和培养

将鲫鱼消毒麻醉后，无菌条件下于超净台内取肝组织，置于含青链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin solution)的磷酸盐缓冲夜(Phosphate buffered solution, PBS)中，持续通入含95% O2和5% CO2的混合气体。将肝组织在PBS中清洗3遍，修整肝组织成体积为 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，包埋于低熔点胶内进行切片操作，切片厚度为300 μm。选取完整切片置于含5%新生小牛血清(FCS)1640培养基的48孔培养板中，每组4孔，每孔6片，于27 ℃、5% CO2条件下培养备用。

1.4 肝切片分组与处理

将肝组织切片放置48孔板内，预培养1 h后，吸出培养基。加入CCl4和不同浓度的姜黄素培养基，观察姜黄素对四氯化碳致肝损伤的保护作用。分组如下：空白对照组，加入1640培养基培养8 h，弃培养基，用1640培养基洗1遍，加入新的1640培养基继续培养4 h，收集上清液及肝组织切片。CCl4损伤对照组，用1640培养基培养8 h，弃培养基，用1640培养基洗1遍，加入12 mmol/L CCl4继续培养4 h，收集上清液及肝组织切片。姜黄素对照组，加入1640培养基养8 h后，弃培养基，用1640培养基洗1遍，换10 μg/ml姜黄素继续培养4 h，收集上清液与组织切片。姜黄素处理组，用1640培养基培养4 h后，弃培养基，加入含不同浓度(1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml)姜黄素的1640培养基继续培养4 h，用1640培养基洗1遍后，再加入含12 mmol/L CCl4的1640培养基，继续培养4 h，收集上清液与组织切片。每组设4个重复。

1.5 生化指标测定

按照试剂盒操作说明分别测定培养上清液中GPT、GOT、LDH、AKP活性，以及肝组织匀浆中SOD、GSH-Px活性和腺苷三磷酸(ATP)、MDA、GSH、TP、Alb含量。

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Nrf2 mRNA和Keap1 mRNA表达

收集肝切片组织，加入适量TRIZOL试剂(TaKaRa公司产品)进行匀浆，参照RNAiso Reagent (TaKaRa公司产品)说明书提取总RNA。

采用紫外-可见分光光度计(Gene Quant1300)，测定RNA浓度和纯度(OD260/OD280值达到 1.8～2.0为符合标准)，用DEPC水调至适当浓度。RT-PCR反应体系：总RNA 10 μg，OligodT(50 μmol/L) 2 μl，反转录缓冲液8 μl，dNTP(10 mmol/L) 4 μl，RNase inhibitor(40 U/μl) 1 μl，M-MLV反转录酶(200 U/μl) 1 μl，其余为RNase free dH2O，反应体系总体积40 μl。实时荧光定量PCR反应按照ExScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa公司产品)说明书，在荧光定量PCR检测系统(ABI PRISM7500 sequence detection system)上进行。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s，72 ℃ 45 s，33个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳分析。内参引物及基因特异引物采用Primer premier 5.0软件设计，由上海杰瑞生物技术有限公司合成。目的基因引物序列如下：Nrf2基因正向引物为5′-GCGAGCGTAGCTCCAGTCTGA-3′，反向引物5′-AAGGCTTGCCGTGCTCGTCT-3′；Keap1基因正向引物为5′-TGCGTGTTGTTCGGGCTCCT-3′，反向引物TCTGGGCGTGTTGAGCGGAG-3′；β-actin基因正向引物为5′-TTGAGCAGGAGATGGAACCG-3′，反向引物5′-AGAGCCTCAGGGCAACGGAAA-3′。

1.7 数据分析

试验数据用SPSS19.0进行处理分析。采用One-Way ANOVA检验法进行显著性分析，结果以平均值±标准差表示。

2 结 果

2.1 姜黄素对鲫鱼肝切片活力的影响

图1显示，鲫鱼肝切片经CCl4处理后ATP含量明显降低，仅为空白对照的60.8% (P<0.01)。加入不同浓度姜黄素后，肝切片ATP活力明显上升，姜黄素浓度为1 μg/ml和5 μg/ml时，肝切片ATP活力活性显著提高(P<0.05)。

2.2 姜黄素对鲫鱼肝切片中GPT、GOT、LDH及AKP活性的影响

鲫鱼肝切片经过CCl4损伤后，引起细胞内酶的释放，培养上清液中GPT、GOT、LDH及AKP的活性明显增加(P<0.01)(图2)。姜黄素处理组中，GPT、GOT、AKP及LDH酶活性较CCl4对照组降低，其中1 μg/ml和5 μg/ml姜黄素处理组中，4种酶的活性被显著抑制(P<0.01或P<0.05)，但10 μg/ml姜黄素对4种酶活性的影响不显著。

1：空白对照组；2：CCl4损伤对照组(肝切片与12 mmol/L CCl4共培养)；3：姜黄素对照组(肝切片与10 μg/ml姜黄素共培养)；4：1 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；5：5 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；6：10 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组。*、**分别表示与CCl4对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。图1 姜黄素对CCl4损伤的鲫鱼肝切片中ATP含量的影响Fig.1 Effects of curcumin on ATP content in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

2.3 姜黄素对鲫鱼肝切片中Alb、TP含量的影响

图3表明，与空白对照组相比，鲫鱼肝组织中TP、Alb含量因CCl4的作用而明显下降(P<0.01)。用5 μg/ml姜黄素处理后， 鲫鱼肝切片中TP、Alb含量显著高于CCl4对照组。

2.4 姜黄素对鲫鱼肝切片中SOD、CAT、POD活性及总抗氧化能力(T-AOC)的影响

CCl4可显著降低鲫鱼肝组织中SOD、CAT、POD活性和T-AOC(图4)。而1 μg/ml姜黄素处理后，SOD、CAT、POD活性及T-AOC均明显升高(P<0.05), 同时5 μg/ml姜黄素处理后，POD和CAT活性也显著提高。

1：空白对照组；2：CCl4损伤对照组(肝切片与12 mmol/L CCl4共培养)；3：姜黄素对照组(肝切片与10 μg/ml姜黄素共培养)；4：1 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；5：5 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；6：10 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组。*、**分别表示与CCl4对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。图2 姜黄素对CCl4损伤的鲫鱼肝切片中GPT、GOT、LDH及AKP酶活性的影响Fig.2 Effects of curcumin on GPT, GOT, LDH and AKP activities in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

1：空白对照组；2：CCl4损伤对照组(肝切片与12 mmol/L CCl4共培养)；3：姜黄素对照组(肝切片与10 μg/ml姜黄素共培养)；4：1 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；5：5 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；6：10 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组。*、**分别表示与CCl4对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。图3 姜黄素对CCl4损伤的鲫鱼肝切片中Alb和TP含量的影响Fig.3 Effects of curcumin on contents of Alb and TP in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

1：空白对照组；2：CCl4损伤对照组(肝切片与12 mmol/L CCl4共培养)；3：姜黄素对照组(肝切片与10 μg/ml姜黄素共培养)；4：1 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；5：5 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；6：10 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组。*、**分别表示与CCl4对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。图4 姜黄素对CCl4损伤的鲫鱼肝切片中SOD、CAT、POD活性及总抗氧化能力(T-AOC)的影响Fig.4 Effects of curcumin on the activities of SOD, CAT and POD and total antioxidant capacity (T-AOC) in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

2.5 姜黄素对鲫鱼肝切片中GSH-Px活性及GSH和MDA含量的影响

图5显示，CCl4可显著降低GSH-Px活性和GSH含量，导致MDA大量生成(P<0.05)。与CCl4对照组相比，1 μg/ml姜黄素显著抑制GSH-Px活性和GSH含量的降低。MDA含量在不同浓度姜黄素处理组中也显著降低(P<0.05)。

1：空白对照组；2：CCl4损伤对照组(肝切片与12 mmol/L CCl4共培养)；3：姜黄素对照组(肝切片与10 μg/ml姜黄素共培养)；4：1 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；5：5 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；6：10 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组。*、**分别表示与CCl4对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。图5 姜黄素对CCl4损伤的鲫鱼肝切片中GSH-Px活性及GSH和MDA含量的影响Fig.5 Effects of curcumin on GSH-Px activity and contents of GSH and MDA in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

2.6 姜黄素对鲫鱼肝切片中Nrf2、Keap1 mRNA表达的影响

与空白对照相比，CCl4显著抑制了Nrf2、Keap1基因表达(图6)。而姜黄素处理后，Nrf2基因表达量明显提升，但姜黄素对Keap1基因表达量无明显影响。

1：空白对照组；2：CCl4损伤对照组(肝切片与12 mmol/L CCl4共培养)；3：姜黄素对照组(肝切片与10 μg/ml姜黄素共培养)；4：1 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；5：5 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组；6：10 μg/ml姜黄素+12 mmol/L CCl4处理组。*、**分别表示与CCl4对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。图6 姜黄素对CCl4损伤的鲫鱼肝切片中Nrf2及Keap1基因表达量的影响Fig.6 Effects of curcumin on Nrf2 and Keap1 gene expression in CCl4-treated precision-cut liver slices in Carassius auratus

3 讨 论

CCl4是一种常见的肝脏毒物，可诱导肝细胞或组织构建损伤模型[20-21]。本实验室前期的研究结果显示，CCl4也适用于鱼类肝损伤模型的构建[22]。 CCl4主要是经过细胞色素P450酶进行代谢，产生三氯甲基和氯自由基，引起脂质过氧化，最终导致肝细胞坏死[23]。本试验通过CCl4损伤鲫鱼肝切片，探讨姜黄素对肝组织的保护作及对Nrf2-ARE抗氧化通路的影响。

腺苷三磷酸(Adenosine triphosphate, ATP) 是生物体内组织细胞生命活动所需能量的直接来源，ATP含量的变化直接影响器官的能量代谢[24]。细胞内缺少ATP，会导致损伤甚至死亡。因此，ATP含量常作为评价器官活力的重要指标[25]。本试验中，CCl4处理后，肝切片活力明显降低，而经不同浓度的姜黄素处理后，肝切片活力有所上升。表明姜黄素可有效抑制四氯化碳对肝组织的损伤。

GPT和GOT为肝脏内两种转氨酶，当肝细胞受到损伤或膜通透性增大时，该酶就会从肝细胞浆中逸出细胞外[26]。GPT活性升高表明胞浆受损，细胞膜通透性增加，GOT活性升高表明肝细胞线粒体受损[27-28]。本试验中，经CCl4处理后，肝切片培养上清液中GPT、GOT、LDH及AKP活性明显上升，表明肝细胞受到损伤。而用姜黄素干预后，这些酶活性显著降低，表明姜黄素可促进鲫鱼肝细胞膜系统的修复。在小鼠的研究中也发现了类似的结果，Naik等[29]用酒精诱导小鼠肝组织损伤后，GPT、GOT和LDH活性显著升高，而用姜黄素处理后，这些酶活性显著降低。

白蛋白(Albumin, Alb)的合成与分泌是由肝脏实质部分完成的。当肝脏受到自由基(ROS)损害时，机体内质网的完整性被破坏[30]，蛋白质的合成速率降低。试验结果表明CCl4可明显降低蛋白质 (Alb、TP) 含量，这与Folmar等[31]研究结果一致。姜黄素处理显著抑制CCl4诱导的Alb和TP含量降低，与宁康健等[32]研究结果类似，说明姜黄素可以促进蛋白质合成，保护受损伤的肝组织。

诸多研究结果表明，鱼类肝损伤与抗氧化系统的破坏以及脂质过氧化有关[32-33]。在鱼类中，CCl4可诱导大量ROS形成，导致抗氧化物质如SOD、CAT和GSH等的大量消耗。同时ROS还可以攻击细胞膜，引起脂质过氧化，导致细胞膜结构和功能的变化[34]。本试验中也有类似现象，当鲫鱼肝切片在CCl4中暴露4 h后，其抗氧化物质(SOD、CAT、POD、GSH-Px活性及GSH含量和T-AOC)显著降低，同时脂质过氧化产物MDA含量显著升高，这些变化反映了肝细胞受自由基损坏的程度[35]。在哺乳动物中，姜黄素的保肝作用主要与其抗氧化能力相关[36]。姜黄素通过提高机体抗氧化能力，减少细胞膜受到的损伤，同时改善脂质过氧化作用，发挥保护肝脏的作用[37-38]。Magda等[39]研究发现姜黄素可以显著抑制酒精诱导的肝细胞损伤中抗氧化酶(SOD、CAT及GSH-Px)活力的降低。钟越等[37]也报道姜黄素对CCl4诱导的脂质过氧化物MDA的产生具有显著的抑制作用。本试验结果显示，1 μg/ml和5 μg/ml姜黄素可抑制鲫鱼肝组织中抗氧化酶(SOD、CAT、POD和GSH-Px)活性以及GSH含量的降低，有利于清除由CCl4诱导产生的自由基，进而降低脂质过氧化物的形成，保护肝细胞。

Keap1-Nrf2/ARE信号通路对抗氧化酶表达起着调控的作用[39-40]，其中Nrf2是该通路中的关键因子。在细胞质中Nrf2与其负调控蛋白Keap1偶联后以失活状态固定于胞质内，在自由基的作用下，Keap1结构改变，与Nrf2解偶联通过氧化应激调节其转录活性，激活抗氧化反应元件(ARE)和抗氧化酶Ⅱ相解毒酶，启动下游抗氧化酶基因的转录[41-43]，调控细胞内抗氧化酶的表达，因而Keap1-Nrf2信号通路是抗氧化应激机制中较为重要的通路[44-45]。CCl4诱导大鼠肝损伤中，增强Nrf2蛋白表达可显著提高抗氧化酶活性，有效改善肝组织损伤程度[46-47]。本试验结果显示，CCl4损伤后，鲫鱼肝组织Nrf2 mRNA、Keap1 mRNA相对含量明显低于空白对照，同时对应的抗氧化酶(SOD、GSH-Px、POD及CAT)活性也明显降低，表明CCl4诱导的自由基，抑制Keap1基因表达，同时促使Nrf2移出细胞核，导致机体中抗氧化酶表达水平降低[48]。用姜黄素处理后，肝细胞中Nrf2 mRNA水平升高，其效果随着剂量升高而增加，而Keap1 mRNA增加趋势不明显，说明姜黄素主要通过促进Nrf2基因表达，促进抗氧化酶产生，抑制肝细胞受损。

总之，本研究中1 μg/ml和5 μg/ml姜黄素对CCl4致鲫鱼肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与姜黄素激活Keap1/Nrf2-ARE通路，促进抗氧化蛋白生成，增强机体对自由基清除能力有关。但是，高浓度(10 μg/ml)的姜黄素保肝作用不明显，其原因还需进一步研究。

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