辣椒类甜蛋白基因家族鉴定及表达分析

刘 潮， 韩利红， 宋培兵， 王德琴， 王海波， 唐利洲

(曲靖师范学院云南高原生物资源保护与利用研究中心/生物资源与食品工程学院/云南省高校云贵高原动植物多样性及生态适应性进化重点实验室，云南 曲靖 655011)

类甜蛋白(Thaumatin-like protein，TLP)因与西非竹竽(Thaumatococcusdanielli)果实中分离到的甜蛋白序列有较高的同源性而得名，主要包括类索玛甜蛋白和渗透蛋白(Osmotin)，属于病程相关蛋白第5家族，存在于多种植物、动物及微生物中[1-2]，能被多种生物或非生物信号所诱导表达[3]，参与植物的防御反应[4-5]。TLP转基因或过表达植物提高了对病原的抗性[6-8]和胁迫环境的耐受性[8-9]。体外试验结果表明TLPs具有抗真菌活性[10]，可通过裂解真菌孢子，抑制孢子萌发等方式对病原性和非病原性真菌产生抑制作用[1]。TLPs也参与了植物的发育进程，一些果实成熟时多个TLP基因高表达[11-13]。TLPs在多种水果、农作物和花粉中具有致敏原活性[14]。目前，已鉴定出28个拟南芥TLPs、31个水稻TLPs和55个杨树TLPs[15-16]。研究者发现，水稻和拟南芥TLP基因存在染色体内和染色体间复制现象[17]，系统发育分析显示TLP基因在生物进化上发生了不对称的增加[2]，陆生植物进化过程中TLP基因含量和多样性得到显著增加[18]。

目前对TLP家族的研究主要限于拟南芥和水稻等模式植物，而辣椒(Capsicumannuum)中该家族的研究未见报道。辣椒属于茄科辣椒属，原产墨西哥，因其维生素C含量高以及食药等多重特殊功效，在世界各国普遍栽培。辣椒苗期、成株期均易发生多种病害，往往造成辣椒生产上毁灭性的损失[19-20]。为全面了解辣椒基因组中TLP家族基因结构和功能特征，本研究从基因组水平上分析TLP家族基因的数目和结构、染色体位置分布、启动子区顺式作用元件、蛋白保守基序、系统进化及时空表达，为进一步研究该家族成员的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 辣椒TLP家族数据获取与鉴定

辣椒(C.annuum)基因组大小为2 936 Mb，分布于12条染色体[21]。以典型TLP蛋白1Z3Q(Musaacuminate)为探针，分别搜索GenBank辣椒蛋白数据库和辣椒基因组数据库(http://peppersequence.genomics.cn)，候选蛋白序列在SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)中对蛋白功能域进行确认，剔除重复序列和不含索马甜家族典型结构域(Thaumatin，THN)序列。

1.2 辣椒TLP蛋白理化特性分析

蛋白质生理生化特征通过Expasy(http://www.expasy.org/tools/)预测，蛋白质信号肽使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测，蛋白质疏水性使用Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)预测。

1.3 辣椒TLP基因及其染色体定位分析

辣椒TLP蛋白对应的基因序列和编码序列(Coding sequence，CDS)从辣椒基因组数据库中下载。使用基因结构显示系统(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制基因结构示意图。通过MEME SUITE在线工具(http://meme-suite.org/tools/meme)预测辣椒TLPs序列的保守基序，基序搜索数目为5，其他参数为默认设置。通过Mapinspect(http://mapinspect.software.informer.com/)绘制染色体基因位置分布图。

1.4 辣椒TLP蛋白氨基酸序列比对与系统进化分析

使用Clustal X对TLP蛋白氨基酸序列进行比对，应用MEGA 5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。NJ进化树分析步长值为1 000，采用泊松校验(Poisson correction)的方法计算距离，其余参数取默认值。

1.5 辣椒TLP基因启动子区特征分析

通过GenBank数据库获取辣椒TLP家族基因转录起始位点上游1 kb序列，通过PlantCARE(http://oberon.fvms.ugent.be:8080/PlantCARE/)数据库进行基因启动子区顺式作用元件分析。

1.6 辣椒TLP基因时空表达分析

从NCBI GEO数据库中下载已发表的辣椒转录组数据[22]，组织特异性取样部位为根、茎、叶、蕾、花和9个发育时期的果实，果实9个发育时期为F-Dev1(自花授粉阶段)、F-Dev2(果实长度1～3 cm)、F-Dev3(果实长度3～4 cm)、F-Dev4(果实长度4～5 cm)、F-Dev5(果实青熟阶段)、F-Dev6(果实成熟阶段)、F-Dev7(果实成熟后3 d)、F-Dev8(果实成熟后5 d)和F-Dev9(果实成熟后7 d)。使用HemI 1.0软件绘制基因表达热图。

2 结果与分析

2.1 辣椒TLP家族成员的鉴定

本研究鉴定了28个具有THN结构域的辣椒TLP家族成员(表1)。蛋白质理化性质分析结果显示，最长的蛋白质序列Capana08g002709包含400个氨基酸残基，最短的Capana01g002559包含191个氨基酸残基，蛋白质分子量介于20 721～40 535，蛋白质等电点介于 4.29～8.72，酸性蛋白占60.71%，且多数为疏水蛋白。

序列比对分析发现，26个辣椒TLPs均含有16个半胱氨酸残基，成员Capana01g002559氨基酸数目较少，缺少前端信号肽序列，只含有15个半胱氨酸残基，成员Capana04g002384的C端包含跨膜序列，仅含有9个半胱氨酸残基。所有成员均具有索玛甜家族标签和保守的REDDD氨基酸残基，后者有助于蛋白质维持适当的三维构象和保持酸裂周围的表面静电势，对TLPs抗真菌活性至关重要[23]。

2.2 辣椒TLP家族基因结构及系统进化分析

基因结构分析发现，辣椒TLP家族基因主要有4种类型(图1)，其中不含内含子和含有1个、2个和3个内含子的基因数目分别为11、9、6和2，含有1个内含子的基因主要为1型相位类型，含有2个内含子的基因主要为1～2型相位组合类型。同一聚类组中内含子相位类型一致的基因可能来源于同一祖先基因或可能新近发生了基因复制扩张事件，而内含子相位不同的基因可能是发生了内含子单独获取或丢失的结果。

对辣椒TLP家族保守氨基酸基序分析，发现5类基序的保守性较强，分别为基序 1(TCGPTDYSKFFKQACPDAYSYAYDD)、基序 2(LDFYDVSLVDGFNLPMSVSPT)、基序 3(TWSGRIWGRTGCNFD)、基序 4(VVGCKSACTAFGTDZYCCTGG)和基序 5(VNNCPYTVWPGILPGAGGAQL)。同一聚类组的辣椒TLPs含有的保守基序一致。28条序列含有基序 2和基序 3，27条序列含有基序 1、基序 4和基序 5。说明该家族蛋白保守性较强。

为全面了解辣椒TLP基因与其他物种同源基因的进化关系，分别选取了拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和杨树(Populustrichocarpa)各10个TLPs与辣椒28个TLPs一起构建NJ系统聚类树(图2)。本研究结果与前人研究结果[2,16]相似，代表性的拟南芥、水稻和毛果杨的10个TLPs分别属于10个聚类组，辣椒TLPs分布在除聚类组1和4外的其他8个聚类组中。其中聚类组5中包含10个辣椒TLPs，成员最多，其他物种该聚类组的TLPs与植株对病原或环境胁迫响应有关，具有抑菌或葡糖苷酶活性[8-9]，聚类组5中的辣椒TLPs可能也具有类似活性，具体功能有待深入研究。其次为聚类组6，包含5个辣椒TLPs成员。

表1辣椒中TLP家族信息

Table1TheinformationofpepperTLPfamily

编号氨基酸长度(aa)分子量等电点总平均疏水指数Capana00g000465252273147.87-0.061Capana00g001983231248108.72-0.077Capana01g000278223242508.57-0.355Capana01g000279230250836.54-0.356Capana01g000280228249584.99-0.268Capana01g000281229252237.36-0.237Capana01g000283251271558.45-0.278Capana01g000284250267927.84-0.285Capana01g000285250274356.18-0.306Capana01g000288253277796.49-0.291Capana01g002559191207214.76-0.241Capana02g002572332344074.63-0.011Capana02g002575303308084.290.258Capana03g001796297314875.200.086Capana04g000180250267574.49-0.204Capana04g000181325339355.03-0.102Capana04g000429249259174.880.023Capana04g001741267288338.24-0.098Capana04g002337303315624.770.054Capana04g002384276296458.040.301Capana05g002197226241118.06-0.101Capana06g000760252262844.540.207Capana08g001931241259015.23-0.117Capana08g002705253270788.100.039Capana08g002709400405364.39-0.116Capana10g001695245260807.370.090Capana12g001167227248384.88-0.284Capana12g001168227248384.88-0.284

2.3 辣椒TLP家族基因染色体位置分析

基因染色体位置分布分析结果显示，辣椒TLP基因分布在9条染色体上(图3)。其中最多的1号染色体上有9个TLP基因，其次为4号染色体，而3号、5号、6号和10号染色体上分别只有1个TLP基因。分析发现，辣椒TLP基因在多条染色体上存在聚集现象，如在1号染色体的5 Mb和167 Mb、2号染色体147 Mb、4号染色体的2 Mb、8号染色体的151 Mb以及12号染色体的52 Mb位置都存在2个或2个以上的基因集中分布的现象。研究发现，聚类组5中的成员来自1号和12号染色体，在染色体上的位置临近，且基因中均仅含有1个外显子，说明这些基因可能来源于共同的祖先基因，是染色体内或染色体间基因复制的结果。

图1 辣椒TLP家族聚类树与基因结构Fig.1 The unrooted phylogenetic tree and gene structure of TLP family in pepper

AT开头的为拟南芥TLP蛋白氨基酸序列;Os开头的为水稻TLP蛋白氨基酸序列;gw开头的为杨树TLP蛋白氨基酸序列(序列gw.IX0046全称为estExt_fgenesh4_kg.C_LG_IX0046);TLPs聚类组编号参照文献[2]和[15]。图2 辣椒与拟南芥、水稻、杨树TLP家族系统进化树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of pepper, arabidopsis, rice, poplar TLPs

图3 辣椒TLP家族基因在染色体上的位置分布Fig.3 The chromosome location of pepper TLP genes

2.4 辣椒TLP家族基因启动子区特征分析

本研究对辣椒TLP家族基因上游1 kb启动子区顺式作用元件进行了分析，发现多个激素响应元件、非生物胁迫响应元件和增强启动元件等(表2)。激素响应元件包括脱落酸(ABRE)、茉莉酸(CGTCA-motif)、赤霉素(GARE-motif)、水杨酸(TCA-element)等响应元件，这些元件的存在说明这些基因处在激素调控的下游，可能在特定的信号通路中发挥作用。非生物胁迫元件包括热激响应元件(HSE)、干旱胁迫(MBS)和防御性响应元件(TC-rich repeats)，这些元件的存在说明这些基因在植物应对高温、干旱和其他环境胁迫过程中起作用。还有部分基因含有病原响应元件W box，可能在植物应对病原微生物等生物胁迫过程中发挥作用。所有成员均含有多个启动增强(CAAT-box)和核心启动子(TATA-box)元件，说明该家族基因具有较强的表达潜力。

2.5 辣椒TLP家族基因组织表达分析

通过Qin等[22]发表的辣椒转录组数据，对TLP家族基因在辣椒中的时空表达进行分析(图4)，发现多数TLP基因表达数值较高。其中基因Capana01g000283、Capana01g000284、Capana00g000465、Capana04g000181、Capana08g002705在检测的所有组织和时期均表现出较强的表达，分别属于聚类组3、聚类组5、聚类组6，而基因Capana01g002559、Capana08g001931和Capana06g000760在多数组织和发育时期均表达较弱，分别属于聚类组8和聚类组10。基因Capana01g000281在辣椒组织中表达较高，而在果实发育各个时期均不表达。基因Capana00g001983、Capana01g000180、Capana04g001741、Capana08g002709和Capana10g001695在果实成熟后表达较低或不表达。基因Capana04g002337和Capana04g002384在辣椒器官中表达较低或不表达，而在果实发育的部分阶段有一定的表达。

3 讨 论

TLPs广泛分布于微生物、植物及动物中[1-2]，超过20个来自不同物种的TLPs具有抗真菌活性[15]。研究结果表明，TLP转基因作物显著提高了对病原真菌的抗性和对多种非生物胁迫的耐受性[8]。本研究共获得28条辣椒TLPs序列，主要有4种基因结构类型，基因结构类型相对单一，同一聚类组中的基因结构一致，说明该家族基因保守性较强。

表2辣椒TLP家族基因启动子区顺式作用元件信息

Table2Informationaboutputativecis-actingelementsinthe1kbupstreampromoterregionofpepperTLPgenes

基因ABRECAAT-boxCGTCA-motifGARE-motifGATA-motifHSEMBSTATA-boxTCA-elementTC-richrepeatsWboxCapana00g000465341Capana00g0019831231241Capana01g000278113371Capana01g00027927113411Capana01g00028035125721Capana01g0002813221511Capana01g0002831319514Capana01g000284120112762Capana01g00028512527511Capana01g0002882951111Capana01g0025592811481Capana02g00257224123711Capana02g0025751721130221Capana03g001796101112401Capana04g0001801811145113Capana04g00018125116921Capana04g00042922151111Capana04g0017412311149121Capana04g00233717214812Capana04g0023841712611Capana05g002197111391Capana06g0007602711232Capana08g00193111612232Capana08g0027052135Capana08g00270912832316Capana10g00169525111383Capana12g001167291135Capana12g001168291135总计86061612917191235202810

ABRE：脱落酸响应元件；CAAT-box：启动增强元件；CGTCA-motif：茉莉酸响应元件；GARE-motif：赤霉素响应元件；HSE：热激响应元件；MBS：干旱响应MYB结合位点；TATA-box：转录起始区-30 bp核心启动子元件；TCA-element：水杨酸响应元件；TC-rich repeats：防御和胁迫响应元件；W box：受伤和真菌激发响应元件。

图中数据为TLP基因在不同组织和果实9个发育时期的表达，表达倍数经过lg2处理，图中颜色越深表示相对表达越强。a：根；b：茎；c：叶；d：蕾；e：花；f：自花授粉阶段；g：果实长度1～3 cm；h：果实长度3～4 cm；i：果实长度4～5 cm；j：果实青熟阶段；k：果实成熟阶段；l：果实成熟后3 d；m：果实成熟后5 d；n：果实成熟后7 d。图4 辣椒TLP家族基因的表达Fig.4 The expression of pepper TLP gene family

系统聚类分析结果显示，辣椒TLP家族基因主要分为8个聚类组，与拟南芥、水稻和杨树分组类似[15-16]，说明该家族基因较保守。基因染色体位置分析发现，辣椒TLP家族多个基因在染色体上存在聚集现象，其中成员最多的聚类组5中的基因主要来自1号和12号染色体，这些结构类型一致的基因可能是进化过程中染色体内或染色体间基因复制的结果。聚类组5中的其他物种TLPs能响应病原或环境胁迫[24]，该组中辣椒TLPs是否具有类似功能有待进一步研究。

研究结果表明，TLP基因在植物器官中持续表达，因该家族成员众多，导致不同的基因在不同的器官或不同的发育期表达不同[4,25]。本研究通过分析辣椒转录组数据发现，大部分基因在根中表达较高，该结果与大豆中部分TLP基因表达类似[26]，水稻中多个OsPR1成员在根中的表达也显著高于叶中的表达[27]。基因Capana01g000283、Capana01g000284和Capana00g000465在各器官和果实的各发育期均表达较强，说明其属于泛表达基因，可能在辣椒整个生命过程中均发挥作用。部分基因在各器官和果实成熟前表达，而果实成熟后表达较低或不表达，说明这些基因参与了辣椒果实的成熟过程。部分基因在根、茎、叶等器官中表达较低，而在果实成熟的中期表达较高，说明这些基因可能在果实成熟的过程中起作用。总体而言，聚类组5和聚类组6中的基因多数表达较高，而聚类组8和聚类组10中的基因多数表达较低。以上结果表明，辣椒TLP家族不同成员在时空表达上具有器官特异性，暗示特定的基因存在着功能的特异性，可能参与了特定器官或生长阶段的发育过程，其具体功能值得深入研究。

对基因启动子区顺式作用元件分析发现，基因Capana01g000283和Capana01g000284启动子区TATA-box数量较高，转录组数据显示其在辣椒多个器官中具有较强的表达水平。该家族多数成员含有多个激素响应元件、生物/非生物响应元件，不同的家族成员含有的顺式作用元件类型和数量不同，基因Capana02g002575和Capana04g000180启动子区均同时含有多个激素和环境胁迫响应元件，说明该家族成员功能复杂多样，可能参与了植物生长发育和应对环境胁迫的多种进程，但是具体哪些基因参与了哪些进程值得进一步深入研究。

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