食管鳞癌患者血清差异表达miRNAs的筛选

丁元杰，马箐，郭旭东，沈艺，魏文强，刘芬

(1首都医科大学公共卫生学院/北京市临床流行病学重点实验室，北京100069；2国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院)

食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一，2015年我国食管癌新发病例约47.8万人，病死约37.5万人[1]。位于太行山脉南部的河南省林州市(林县)是我国食管癌的高发区，食管癌发病率、病死率均居全国前列，给当地造成了严重的疾病负担[2]。我国食管癌以食管鳞癌(ESCC)为主, 其起病隐匿，早期临床症状不明显，多数患者就诊时已处于晚期，预后较差。研究[3]显示，早期食管癌治疗后5年生存率可达85%，而中晚期食管癌治疗后5年生存率仅有20%左右。因此，“早期发现、早期诊断、早期治疗”的防治策略能有效降低食管癌的发病率和病死率。碘染色内镜活组织检查是常见的食管癌确诊方法，但存在感染风险高、患者依从性差等缺点。ESCC早期检测血清标志物如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)199和鳞状细胞癌抗原(SCCA)的灵敏度或特异度较低，不能满足临床及人群筛查的需要[4]。因此具有高度灵敏度和特异度的新型肿瘤生物标志物的探索是目前的研究热点。小分子RNAs(microRNAs, miRNAs)是一类大小约22 nt的内源性非编码RNA，可以通过和靶基因mRNA的3′非翻译区(UTR) 碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达[5, 6]。miRNAs在物种进化中相当保守，表达具有严格的组织特异性和时序性。miRNAs在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等[7]，并且在肿瘤发生、发展的多个环节中发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用[8]。由于miRNAs的特殊结构，使其可以抵御RNAs酶的降解，在外周血中能够稳定地存在[9]。因此，了解miRNAs在外周血中的表达情况，有助于发现与肿瘤发生相关的miRNAs，从而进一步研究其在肿瘤发生、发展中的作用机制。2016年2～5月，我们通过高通量miRNAs微阵列芯片技术平台，初步筛选林州市ESCC患者血清中差异表达的miRNAs，为进一步在高发区人群中构建与ESCC发病相关的miRNAs差异表达谱奠定基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料 2014年10月～2015年10月河南省林州市肿瘤医院首次经组织病理学确诊的Ⅰ期ESCC患者52例(观察组)，其中男24例、女28例，年龄(59.0±4.1)岁，所有患者术前均未接受化疗、放疗或其他任何相关的肿瘤治疗。随机选取同期参加食管癌早期筛查项目的队列人群中性别、年龄匹配(1∶1，±5岁)的52名健康对照者(对照组)。所有纳入者均知情同意并签署知情同意书。本研究经伦理委员会审核同意。

1.2 主要试剂及仪器 miRNA提取试剂盒mirVanaTMPARISTM(Cat#AM1556，Ambion，美国)，miRNA标记和杂交试剂盒 (Agilent，美国),基因表达清洗缓冲液 (Agilent，美国)，RNA 6000 Nano Kit(Agilent，美国), RNA 6000 Pico Kit(Agilent，美国), 小RNA试剂盒 (Agilent，美国)等。微阵列扫描仪 (Agilent，美国)，杂交舱 (Agilent，美国),杂交舱垫片 (Agilent，美国) ,杂交炉 (Agilent，美国)，杂交炉转子 (Agilent，美国) ,生化分析仪Bioanalyzer 2100 (Agilent，美国)，分光光度计NanoDrop ND-2000(ThemroScientific，美国)， 1.5 mL微型离心管(Eppendorf，德国), 磁力搅拌棒(Corning，美国),微型离心机(Eppendorf，德国)等。

1.3 血清miRNAs检测 ①两组均于清晨采集空腹外周血4 mL至血清采集管中，在室温下静置1 h后于低温离心机中以4 ℃、820 g/min离心10 min；吸取约1 mL上清转至洁净的1.5 mL离心管中，再次离心(4 ℃，16 000 g/min)10 min，小心吸取上清到冻存管中，置于-80 ℃保存备用。② 总RNA的提取和纯化 使用mirVanaTMPARISTM试剂盒提取血清中总RNA，步骤参照试剂盒说明书。抽提所得总 RNA经NanoDrop ND-2000分光光度计测定浓度及OD260/OD280，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent，美国)电泳检测RNA完整性。两组血清样品的浓度及纯度分析结果显示，总RNA的总量及质量符合miRNA微阵列的检测要求。③ miRNA标记和杂交 采用Agilent miRNA芯片配套的试剂盒，按照标准操作流程的标记部分对样品中的miRNA分子进行荧光标记。按照Agilent miRNA芯片配套提供的标准操作流程和配套试剂盒，进行样品的杂交实验。在滚动杂交炉中，Hybridization Oven，55 ℃，20 rpm，滚动杂交20 h。杂交完成后在洗缸中洗片。④ 芯片扫描及数据分析芯片结果采用Agilent Microarray Scanner(Cat#G2565BA，Agilent，美国)进行扫描，用Feature Extraction software 10.7 (Agilent，美国)读取荧光信号强度值，软件设置Scan resolution=5 μm, PMT 100%。

1.4 统计学方法 Gene Spring Software11.0软件进行归一化处理。以hsa-miR-1228-3p的中位数为内参进行标准化[10]，标准化后进行wilcoxon秩和检验，P值经过FDR校验。差异表达miRNAs筛选标准: 信号检测结果显示变化方向和程度一致,ESCC患者和对照血清中的miRNAs荧光信号强度差异倍数(FC)的绝对值>2(代表miRNAs表达上调或下调)、P< 0.05，FDR<0.1 。

2 结果

观察组hsa-let-7b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1238-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1290、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-3663-3p、hsa-miR-4281、hsa-miR-4455、hsa-miR-4516、hsa-miR-451a、hsa-miR-4532、hsa-miR-4634、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-4763-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-6090、hsa-miR-6515-3p、hsa-miR-92a-3p的荧光信号强度分别为4.661、689.033、338.070、10.635、21.280、7.940、6.791、46.552、9.745、17.944、6.714、25.561、26.300、243.228、15.900、306.905、503.306、25.997、17.814、101.998、49.293、65.336、50.498、1021.312、7.483、29.814，对照组分别为1.076、1.075、11.258、3.238、6.730、1.479、1.953、5.693、1.236、5.586、1.166、4.856、5.698、52.349、3.851、58.029、41.151、3.994、2.451、24.575、10.980、8.450、11.205、187.145、2.947、6.666。

观察组和对照组26个miRNAs的FC分别为4.33、640.76、30.03、3.28、3.16、5.37、3.48、8.18、7.88、3.21、5.76、5.26、4.62、4.65、4.13、5.29、12.23、6.51、7.27、4.15、4.49、7.73、4.51、5.46、2.54、4.47。与对照组比较，观察组的26个miRNAs表达水平均上调，荧光信号强度FC绝对值均>2、P均<0.05，FDR均<0.1。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，越来越多与肿瘤发生、发展及预后相关的分子标志物被发现，miRNAs是其中的一类。miRNAs通过与靶mRNAs的3′UTR特异性结合，降解靶mRNAs或抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达，从而参与到一系列的生物学进程当中，包括肿瘤的发生与发展。目前已有许多miRNAs被发现与肺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和胃癌等多种肿瘤的发生密切相关[11～13]。由于miRNAs是在转录后水平调控癌基因/抑癌基因的翻译，癌基因/抑癌基因的激活是肿瘤发生的早期事件，因此某些特异性miRNAs有希望成为识别癌症早期病变的标志物。

研究表明miRNAs在不同肿瘤中通过促进或抑制癌基因/抑癌基因的表达，进而参与调控肿瘤细胞的增殖和凋亡。Calin等[14]发现在慢性淋巴细胞白血病中，易于出现突变、丢失的染色体13ql4.3区含有miR-15和miR-16，约68%的慢性淋巴细胞白血病患者有miR-15和miR-16缺失或下调，提示miR-15、miR-16与慢性淋巴细胞白血病可能存在关联。

miRNAs作为肿瘤预警或诊断的生物标志物具有其优势，相比较于传统血清生物标志物，miRNAs在血清中的表达更稳定，反复冻融、极端pH条件等处理对其完整性影响较小[15]。其次，外周血中的miRNAs易于获得，侵害性小，有利于在大规模的人群筛检中应用。miRNAs的表达具有时相性和组织特异性[16,17]，不同分化程度的细胞所产生的miRNAs表达谱也不尽相同，这些特性使得miRNAs有希望成为早期癌症诊断的高效标志物。基于芯片技术的出现，使得我们能够高通量的筛选外周血中差异表达的miRNAs。本研究通过高通量芯片在52对ESCC与正常对照血清中筛选出的26个差异表达的miRNAs，均在ESCC患者血清中表达上调。其中，有研究报道血清hsa-miR-1246可以作为ESCC的诊断标志物[18]，能有效区分ESCC和健康对照(灵敏度71.3%，特异度73.9%)，其表达水平与肿瘤分期相关，并可以作为肿瘤预后的独立危险因素。多项研究发现[19,20]，let-7b在肺癌患者中表达下调，可能是一个肿瘤抑制基因，并且与肿瘤耐药性相关。Vishnubalaji等[21～23]报道miR-320c通过与SOX4、FOXM1和FOXQ1靶向结合沉默其表达，可以抑制结直肠癌的发生、发展。Sromek等[24,25]发现非小细胞肺癌患者治疗前外周血中miR-16水平显著高于健康对照，而经过手术治疗后的患者miR-16浓度恢复正常水平，提示外周血中miR-16可以作为非小细胞肺癌的生物标志物。

以上研究结果均显示外周血中miRNAs与癌症的发生、发展及预后存在关联，这些miRNAs与不同肿瘤的关联提示其可能成为肿瘤早期发现和早期诊断的候选生物标志物。本研究利用我国特有食管癌高发区血清样本，初步筛选出hsa-let-7b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-1207-5p、hsa-miR-1238-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-1290、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-3663-3p、hsa-miR-4281、hsa-miR-4455、hsa-miR-4516、hsa-miR-451a、hsa-miR-4532、hsa-miR-4634、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-4763-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-6090、hsa-miR-6515-3p、hsa-miR-92a-3p 等26个差异表达的miRNAs。接下来我们将进一步构建特异性的miRNAs表达谱来进行ESCC筛查或诊断，但该结果仍需要大样本的人群实验进行验证。

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