脑胶质瘤组织中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表达变化及其意义

乔晓霞，谢英彬，张洁，檀艳丽，孙彤彤，方川

(1河北大学，保定 071000；2河北大学附属医院)

脑胶质瘤是临床常见的原发性脑肿瘤，经积极治疗后预后差，生存期短，复发率高。酸性神经酰胺酶(ASAH1)是细胞膜重要组成部分神经鞘脂代谢平衡系统中的重要酶，参与细胞增殖与凋亡，其在人体各类肿瘤中的重要作用也逐步被关注及研究[1]。转化生长因子β1(TGF-β1)是重要细胞因子，它广泛参与并具有调节机体细胞凋亡、增殖和分化等功能[2,3]。Caspase家族是调控细胞程序性死亡的酶类，其中半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase-3)是细胞早期凋亡过程中重要的效应分子[4]。在脑胶质瘤中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白的表达情况及相关性国内外鲜有报道。因此，本研究观察了脑胶质瘤组织中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表达变化，并分析三种蛋白的相关性，旨在为临床上脑胶质瘤的诊疗及预后评估提供新的分子标记物。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月～2016年12月河北大学附属医院收治的脑胶质瘤患者70例，男36例，女34例；年龄16～67(48.89±12.94)岁；所有病例均经病理证实，且术前均未行抗肿瘤治疗。按WHO胶质瘤分类标准分为低级别者(Ⅰ～Ⅱ级)32例、高级别者(Ⅲ～Ⅳ级)38例。手术切取脑胶质瘤及癌旁组织各70例份，分别计为观察组和对照组。

1.2 组织ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白检测方法 采用免疫组化SP法。所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片为阳性对照。结果判定标准：ASAH1阳性表达于胞质，TGF-β1、Caspase-3阳性大部分表达于胞质、偶见于胞核，均以棕黄色颗粒特异性分布于胞质或胞核者视为阳性。由2名病理医师分别独立执行，采用双盲法阅片，采用Krajewska描述的方法对结果进行半定量分析。细胞染色强度计分：无色计0分、浅黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分。随机选择10个高倍视野(×400)计数阳性细胞，阳性细胞占0～4%计0分，5%～24%计1分，25%～49%计2分，50%～74%计3分，75%～100%计4分。免疫组化染色指数=阳性细胞数×染色强度，染色指数0判为阴性(-)，1～2判为弱阳性(+)，3～4判为中等阳性(++)，4以上判为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。采用秩和检验检测低、高级别脑胶质瘤组织中蛋白的表达差异，采用Spearman相关性分析三种蛋白表达的相关性，总体生存分析的比较用Breslow检验并绘制Kaplan-Meier生存曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白阳性率比较 观察组ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白阳性率分别为81.42%、87.14%、75.71%，对照组分别为16.67%、33.33%、25.00%，两组比较，P均<0.05。观察组低、高级别者ASAH1蛋白阳性率分别为68.75%、92.10%，TGF-β1蛋白阳性率分别为81.25%、92.10%，Caspase-3蛋白阳性率分别为87.50%、65.79%，两者比较，P均<0.05。

2.2 观察组ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表达阳性与阴性者生存时间比较 对受试者进行6个月～3年随访，平均(19.40±8.52)个月。ASAH1蛋白表达阳性者(57例)与阴性者(13例)中位生存时间分别为10、23个月，TGF-β1蛋白表达阳性者(61例)与阴性者(9例)中位生存时间分别为10、20个月，Caspase-3表达阳性者(53例)与阴性者(17例)中位生存时间分别为13个月、6个月，两者比较，P均<0.05。

2.3 观察组ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表达相关性分析 观察组ASAH1蛋白与TGF-β1表达呈正相关(r=0.652，P<0.05)，ASAH1、TGF-β1与Caspase-3表达均呈负相关(r=-0.427、-0.317，P均<0.05)。

3 讨论

脑胶质瘤是恶性程度高、侵袭性强的中枢神经系统肿瘤，临床手术治疗辅以放化疗的综合性治疗是主要的治疗手段，但目前预后仍然很差，生存期短。脑胶质瘤治疗不成功的原因通常是因为诊断较晚，缺乏特异性诊断标记物，或是脑胶质瘤细胞高增值及侵袭的特性[5]。故从分子角度寻求新治疗方法的必要性大大增加。

ASAH1能将神经酰胺(Cer)催化水解为神经鞘氨醇(SPH)，SPH进一步磷酸化生成1磷酸神经鞘氨醇(S1P)，ASAH1通过调控Cer、SPH、S1P三种物质的平衡，进而调控细胞的生长、增殖、分化、存活、凋亡等生物学活动[6]。ASAH1被发现在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等多种人类肿瘤中过表达，参与增殖、凋亡、侵袭、耐药等生物效应，在肿瘤的发生发展中起重要作用[7,8]。Vejselova等[9]发现，运用ASAH1抑制剂ceranib-2后，乳腺癌肿瘤细胞的增殖能力下降，在敲除了黑色素瘤细胞中ASAH1基因后，细胞生长周期受到抑制，凋亡加速[10]。Mescic等[11]发现，C-5-炔基尿嘧啶衍生物可通干扰ASAH1活性来扰乱ASAH1介导的鞘脂信号传导，诱导肿瘤细胞死亡。研究[12～14]证实，在胶质母细胞瘤(GBM)细胞中ASAH1表达升高，导致下游产物S1P富集，使肿瘤微环境更适合GBM细胞生长，S1P还能上调GBM细胞尿激酶纤溶酶原激动剂及其受体，同时增强侵袭性的分子MMP表达，提高GBM细胞侵袭力。Doan等[12,15]还发现，ASAH1高表达的GBM对放疗明显抵抗，在应用了ASAH1抑制剂卡莫氟或特异性抗体后，肿瘤细胞对放疗敏感性显著升高，放疗后细胞凋亡显著增加。然而，ASAH1在脑胶质瘤细胞中调控细胞凋亡的机制尚未完全阐明。

TGF-β1是由多种细胞包括免疫细胞、基质细胞甚至肿瘤细胞分泌的多功能组织因子，具有调节细胞增殖、凋亡、分化和组织稳态等多种功能[16]，目前被认为是重要的致癌因子。在神经鞘磷脂代谢中，TGF-β1不仅可通过ALK5/Smad2途径增加ASAH1的表达和活跃度[17]促进Cer分解成SPH，也可进一步上调SPH激酶的表达活性，从而抑制细胞凋亡[18,19]，生成的底物S1P也能能促进血管生成[20]。Zhang等[21]发现，在脑胶质瘤组织中TGF-β1的表达与微血管密度密切相关。但在脑胶质瘤组织中，TGF-β1是否也能调控ASAH1发挥相关作用，国内外文献未见详细报道。

Caspase-3是细胞早期凋亡效应分子，在凋亡过程中都能起关键作用[22]。ASAH1是水解Cer的关键酶，神经酰胺通过激活外源性死亡受体通路，进而激活Caspase-3和一系列的级联反应，诱发肝细胞凋亡[23]。也有研究发现，神经酰胺诱导细胞凋亡的机制是通过释放细胞色素C，进一步激活Caspase-9、Caspase-3导致细胞凋亡[24]。Azuma等[25]发现，ASAH1过表达可使Caspase-3 mRNA水平降低，提示ASAH1可能对Caspase-3通路有直接抑制作用。Kim等[26]也发现，在肺癌细胞中加入TGF-β1后能明显抑制活性Caspase-3的表达，从而抑制细胞凋亡。在脑胶质瘤中ASAH1、TGF-β1是否对Caspase-3有抑制作用，并未被证实。

本研究显示，观察组ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白阳性率均高于对照组；观察组低级别者ASAH1、TGF-β1蛋白阳性率低于高级别者，低级别者Caspase-3蛋白阳性率高于高级别者；ASAH1、TGF-β1蛋白表达阳性者中位生存时间短于阴性者，Caspase-3表达阳性者中位生存时间长于阴性者；观察组ASAH1蛋白与TGF-β1表达呈正相关，ASAH1、TGF-β1与Caspase-3表达均呈负相关。提示脑胶质瘤组织中ASAH1、TGF-β1、Caspase-3蛋白表达升高，检测上述蛋白有助于此病病情判断及预后评估。

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