自噬选择性与心脏衰老的关系研究进展

石灵，阮云军，冯骞，苏双，林捷琪，杨儒于，罗昊，吴赛珠

(南方医科大学南方医院，广州 510000)

根据2016年《中国心血管病报告》，中国心血管疾病的病死率居死亡构成首位。年龄是心血管疾病发展的主要危险因素，年龄>50岁者缺血性心脏病的发病率逐年升高[1]。随年龄增长，心肌细胞容易出现损伤，损伤的细胞进一步加重心脏的老化程度，且损伤的心肌细胞无法通过细胞增殖代偿，心肌细胞依赖于细胞质量控制以保持活力[2]。自噬是细胞维持内环境稳态的重要机制。营养充足的条件下细胞自噬功能维持在较低水平。饥饿、应激或雷帕霉素干预可快速激活细胞的自噬功能，通过溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质，提供生物合成所必须的元素、补充机体能量，维持细胞的生存。细胞的自噬功能随着年龄的增长而下降，提示自噬与生物体的衰老有密切联系。目前关于自噬在心肌细胞中的作用报道较少，现将自噬的选择性与心脏衰老的关系相关研究综述如下。

1 自噬选择性

自噬是一种高度保守的降解过程，其激活涉及到多个蛋白质复合体在不同步骤中的相互作用。自噬过程至少包括四个步骤：激活、吞噬泡的形成和延伸、胞浆内成分的吞噬和运输至溶酶体进行降解。自噬活动受细胞内外多种信号的共同调节，包括mTOR、Akt、AMPK、PI3K、Sirtuins、NAD+、IGF-1、Atg等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是自噬的一个关键调节因子。mTOR包括mTORC1和mTORC2两种不同的复合体。其中，mTORC1收集广泛的细胞信号， mTORC1被激活时对自噬进行负性调控。

当营养不足时，AMPK被激活并启动自噬。活化的AMPK通过磷酸化mTORC1 复合物中的Raptor亚基或激活TSC1/2蛋白来抑制mTORC1，磷酸化Ulk1形成Ulk1/Atg13/Fip200三聚体复合物，Ulk1复合物激活由核心蛋白Beclin1(Atg6)、Vps34和Vps15组成的PI3K复合物。这种复合物促进了吞噬泡的成核。AMPK还可以通过直接激活Ulk1和下游的PI3K复合物来上调自噬。而在营养充足的条件下，PI3K/Akt信号通路通过激活mTORC1来抑制自噬。Akt磷酸化并抑制TSC1/2蛋白，从而激活mTORC1。Akt也可以直接磷酸化mTORC1的一种内源性抑制物PRAS40使其失活，进而导致mTORC1的激活，自噬受到抑制。激活的mTORC1抑制Ulk1、Beclin1-VPS34-Vps15的活性，进而下调自噬。

吞噬泡延伸形成自噬体涉及到两种泛素样蛋白共轭系统，Atg5-Atg12-Atg16L和微管结合蛋白1轻链3(LC3)。可溶性的LC3被atg4分解成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺(PE)结合，其产物LC3Ⅱ与自噬体膜特异性融合，对吞噬泡的延伸和底物的识别起到重要作用。吞噬泡不断延伸，将待降解的底物吞噬包裹形成自噬体。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，运输的底物随之被降解。

自噬降解底物最开始被认为是一种非选择性的过程。最新研究发现自噬可以选择目标细菌、蛋白质复合体和细胞器，包括过氧化物酶体、雌激素受体和线粒体来进行降解。多数研究都着重于自噬体中的线粒体降解，即损伤的线粒体被自噬作用特异性降解，这个过程也被称为线粒体自噬。在电子显微镜下观察到成年小鼠心肌细胞中仅包含线粒体的自噬体，证实了心脏存在线粒体自噬活动[3]。针对自噬选择性相关的信号通路和蛋白质的研究为特异性延缓器官老化或疾病发展指出了新的方向。

PINK1/Parkin通路通过标记去极化的线粒体介导自噬。正常情况下，丝氨酸/苏氨酸激酶PINK1进入并定位于线粒体内膜上，当线粒体出现去极化损伤，线粒体膜电位下降时，PINK1无法进入线粒体内膜，在线粒体外膜(OMM)上积累。PINK1介导线粒体融合蛋白Mfn2抗体的磷酸化，使其作为线粒体受体与Parkin相互作用[4]。Parkin在转移到线粒体后，参与多种线粒体外膜蛋白的泛素化，底物蛋白的泛素化是自噬性降解的信号。泛素化的底物蛋白通过泛素相关结构域(UBA)连接自噬接头蛋白p62/Sqstm1，再通过LIRmotif受体与LC3连接，将泛素化的底物运送至自噬体。p62/Sqstm1在功能障碍的线粒体、折叠错误的蛋白质和蛋白质复合体的清除中起到作用。但p62/Sqstm1在PINK1/Parkin介导的线粒体自噬中并非是不可或缺的，最近的研究发现视神经蛋白和NDP52同样作为重要的自噬接头蛋白，参与线粒体自噬[5]。

线粒体自噬还可以不依赖于底物泛素化和接头蛋白，而是直接利用线粒体上可作为自噬受体作用的蛋白质和脂类发生。如BNIP3和NIX/ BNIP3L基因，通过LIRmotif受体直接连接吞噬泡上的LC3和γ-氨基丁酸受体相关蛋白，介导线粒体自噬。心磷脂和fUNDC1同样在线粒体中可起到自噬受体的作用。Murakawa等[6]发现Bcl-2样蛋白13(Bcl2-L-13)是一种线粒体自噬受体，类似于BNIP3和NIX/ BNIP3L基因，过表达的Bcl2-L-13可诱导线粒体自噬。另外，细胞中除线粒体外的其他细胞器诸如过氧化物酶体、内质网、高尔基体、核糖体等是否也存在类似的自噬受体，仍有待研究。

2 自噬选择性与心脏衰老

衰老细胞中常可见到受损蛋白质和线粒体的堆积。增强的自噬可以抵消蛋白质复合体和受损细胞器在细胞内的年龄相关的积累。在不同器官抗衰老模型的研究中，均发现了自噬增强的证据。首先发现自噬与寿命相关的动物模型是果蝇，增强的自噬延长了衰老果蝇的平均寿命[7]。在哺乳动物模型中，自噬相关蛋白Atg5全身过度表达的转基因小鼠所检查的组织，包括心脏、肺脏、骨骼肌及大脑中均可见自噬通量的增加，自噬增强的小鼠拥有更长的生存期和抗衰老的表型，如胰岛素敏感性的提高，体质量下降，和运动机能的改善[8]。相反，自噬减少与疾病发展和寿命缩短相关。关键的自噬基因的功能丧失突变会导致黑腹果蝇的寿命短缩[7]。在小鼠中，神经元损伤伴随的自噬信号通路障碍会导致年龄相关的选择性的神经退行性疾病[9]，缺乏自噬接头蛋白p62/Sqstm1的小鼠有过早衰老的表型和寿命缩短[10]。综上所述，自噬在延缓衰老中发挥重要的作用。

目前普遍认为自噬随着年龄的增长而减少。Russ等人报告了大鼠骨骼肌基础自噬随年龄增长而减少[11]，Uddin等人在老年小鼠的胸腺和肝脏中观察到LC3蛋白水平降低和自噬体数量减少[12]。然而，自噬水平随年龄变化的所有研究结果并非全部一致，在衰老心脏中观察到自噬增加、减少或不变的结果均有报道[13～15]。有研究[13]观察到衰老小鼠的心脏有较高的Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ水平。另一项研究[14]发现，随年龄增长，心肌组织中LC3Ⅰ表达水平增加，而Beclin1和p62水平无变化，而Taneike等[15]则报道了小鼠心脏组织中LC3Ⅱ表达水平随年龄增长而减少。上述研究结果相去甚远，这可能是不同的实验设计、物种和遗传背景差异导致了实验误差。但这些研究没有直接检测老化心脏中的自噬通量，虽然LC3Ⅱ表达水平的增加侧面表明了自噬体数量的增加，但自噬体只是整个自噬过程中的一步，自噬活动的增强或者自噬通量减少都可能造成自噬体数量的积累，无法仅通过自噬体数量改变说明自噬水平的变化。同样，LC3Ⅱ表达减少也可能是由于自噬通量增加而使自噬体降解增多，或自噬体形成数量的减少。

年龄是心血管疾病发展的主要危险因素，随心脏衰老可出现一系列并发症如动脉粥样硬化、心脏瓣膜钙化、左心室肥厚、心力衰竭等。长期过量的脂肪摄入抑制心脏的自噬通量，导致大鼠出现心肌细胞凋亡和心功能不全[16]。而限制能量(CR)的老年大鼠心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍的现象得到遏制，左室功能恶化被阻断[17]。给予小鼠mTOR抑制剂雷帕霉素，能改善衰老心脏的线粒体蛋白质组，并逆转心脏功能出现年龄相关性下降[18]。

线粒体质量控制是心脏抗衰老的关键。心肌细胞中功能障碍线粒体的积累在衰老过程和年龄相关心脏病的发展中起主要作用。细胞中的活性氧类(ROS)是线粒体呼吸的副产品。在正常情况下，低水平的ROS具有重要的信号功能，包括在稳态水平下调节自噬。然而，当线粒体出现功能障碍时，线粒体电子泄漏导致线粒体氧化磷酸化，以及与ROS产生相关生物酶和抗氧化蛋白表达的失衡，造成ROS水平升高，过量的ROS破坏DNA、蛋白质、细胞膜和细胞器等，导致受损线粒体堆积，堆积的线粒体进一步促进了ROS生成，形成恶性循环[19]。年轻健康的心脏可以通过自噬活动迅速清除损伤细胞器，衰老细胞中过量生成的ROS可能参与修改自噬相关调控蛋白并减少心脏的选择性自噬，功能障碍线粒体随自噬下降而在细胞内累积，共同促进心脏衰老。

Parkin基因敲除小鼠尽管在早期可以表现出正常的心脏表型，但随着年龄增长，这些小鼠的心肌细胞中出现了异常的线粒体累积[20]。尽管PINK1和Parkin基因在老化心脏中的表达水平并无变化，功能障碍线粒体对Parkin的募集明显衰减，线粒体清除率随之下降。老化细胞中p53的表达上调，p53与Parkin相互作用使其无法正常转位至线粒体，自噬减少[21]。反之，心脏过度表达Parkin，提高了线粒体的周转率并抑制心肌老化。

此外，线粒体含有独立的基因组，编码参与线粒体呼吸的数个亚基。线粒体DNA(mtDNA)突变随着年龄的增长而增加，导致线粒体功能受损，积累的ROS又进一步破坏mtDNA。随时间推移，正常的线粒体基因组逐渐减少。Siegmund 等[22]给予mtDNA消耗综合征模型小鼠低剂量雷帕霉素，小鼠寿命得到延长。Li-Harms等[23]发现线粒体DNA突变的积累导致mTOR过度激活，抑制了POLGm/m小鼠红系细胞和成纤维细胞(MEFs)的自噬。自噬下降导致线粒体清除减少，功能障碍线粒体逐渐积累，细胞出现衰老。以上研究均表明线粒体DNA突变通过减少线粒体自噬使寿命短缩，但线粒体DNA突变如何引起mTOR信号异常增加，线粒体DNA突变的积累如何影响老龄小鼠心脏自噬的问题仍需解答。

心肌细胞随年龄增长积累大量的脂褐素，脂褐素主要由不可降解的交联蛋白质、脂类、少量碳水化合物和金属组成，是衰老和有丝分裂后细胞的标志。随着年龄的增长，积累的脂褐素聚合体占据溶酶体的大部分体积，影响溶酶体功能。并且，溶酶体水解酶会优先分配给承载脂褐素的溶酶体内，但脂褐素无法被降解，溶酶体水解酶的无效积累使能有效进行自噬作用的酶减少，自噬通量下降，细胞功能进一步老化。

在衰老、应激等状态下，线粒体内未折叠或错误折叠的蛋白质不能被及时降解而大量堆积，使线粒体蛋白质稳态失衡，从而激发线粒体的未折叠蛋白反应(UPRmt)，包括分子伴侣的激活和线粒体质量控制机制[24]。给予线虫和哺乳动物细胞NAD+，UPRmt通路可被强烈激活，并延长线虫和小鼠的寿命[25]。由此可见，UPRmt通路对于线粒体质量控制的长期维持非常重要，起到对抗心脏衰老和延长寿命的作用。近年来关于线虫的UPRmt通路研究炙手可热，但对于哺乳动物的UPRmt通路研究仍然没有较清楚地认识。值得注意的是，能够诱导UPRmt的刺激也能够诱导线粒体自噬的发生，如线粒体电子转移链泄漏、mtDNA突变、大量错误折叠蛋白质在线粒体内的累积等。

综上所述，自噬通过清除细胞毒性蛋白质聚集体和功能障碍细胞器发挥有效地抗衰老作用，长期热量限制和运动能增加心脏的自噬作用，有利于心血管功能提升和生存期延长[26]。自噬水平随年龄增长而降低。心肌细胞主要依赖于线粒体自噬保持活力，选择性的自噬可特异性降解心肌细胞受损线粒体，改善心脏功能。衰老心肌细胞中过量生成的活性氧簇可参与修改自噬相关调控蛋白，减少心脏的选择性自噬，自噬选择性降低可导致衰老线粒体在心肌细胞内累积，促进心脏衰老。

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