地塞米松体外短期处理影响Ⅰ型调节性T细胞与自然调节性T细胞平衡*

黄丽艳 欧志兵 谢 婷 廖湘平 张 健 刘文培 瞿小旺

(南华大学附属郴州医院转化医学研究所，郴州 423000)

糖皮质激素是免疫系统重要的调节器，内源性激素对新陈代谢、生长发育等许多生理过程都极其重要，还可以保护机体免受强烈免疫反应的不良影响。1948年以来，合成的糖皮质激素由于其强有力的抗炎和免疫抑制活性，被广泛应用于治疗多发性硬化、系统性红斑狼疮、关节炎等自身免疫性疾病、过敏、肿瘤以及器官移植后预防排斥反应[1-4]。然而糖皮质激素的分解活动会在间质组织中引起严重的副作用，如皮肤萎缩、肌无力和骨质疏松；而糖皮质激素在肝脏的新陈代谢尤其是糖异生会导致胰岛素抵抗和糖尿病。因此，在分子水平上理解这种多效激素对不同细胞类型的特异性影响，是维持糖皮质激素的治疗效果和克服副作用发展策略所必需的。

调节性T细胞(Treg)，是1995年由Sakaguchi等[5]首次报道的一种具有免疫抑制作用的T细胞亚群，其表型为CD4+Foxp3+CD25+T[6]。Treg在机体免疫稳态、 移植耐受、 肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等过程中都发挥重要作用，是维持机体免疫耐受的重要调控者[7,8]。Ⅰ型调节性T细胞(Tr1)作为诱导性调节T细胞，表型为CD4+CD25-LAG-3+T，主要通过分泌 IL-10、TGF-beta等物质而发挥免疫负调控作用[9]。Tr1在过敏性疾病及器官移植后发挥免疫耐受作用[10,11]，在炎症性肠病中Tr1可以进入炎症部位发挥抗炎作用[12]；Tr1缺乏或功能受损会导致多发性硬化等自身免疫性疾病[13]；然而Tr1过多会导致肿瘤细胞的扩增和免疫逃逸[14]。在丙型病毒性肝炎患者的肝脏组织内Tr1过表达会导致干扰素治疗的无反应性，从而进展为肝炎后肝硬化和肝癌[15]。

调节性T细胞在有炎症性疾病的人和小鼠体内都可以被地塞米松诱导[16,17]，地塞米松可以恢复过敏症患者体内调节性T细胞的数量和功能[18]，然而机制尚不明确。本研究拟通过地塞米松体外短期处理外周血淋巴细胞，探究地塞米松对调节性T细胞平衡的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂

1.1.1研究对象 收集健康人外周血样，所有纳入对象均无肝炎、艾滋、梅毒等血液传播疾病，近期均未使用过糖皮质激素。该研究在郴州市第一人民医院伦理委员会和志愿者知情同意下进行。

1.1.2流式抗体 鼠抗人CD3 APC-eFluor 780(SK7)、鼠抗人CD8a APC(OKT8)、鼠抗人CD127 APC(eBioRDR5)、兔抗人Foxp3 PE-eFluor®610(PCH101)购于美国eBioscience公司；鼠抗人CD4 BUV737(SK3)、鼠抗人CD8 BUV737(SK1)、鼠抗人CD25 PE-CyTM5(M-A251)购于美国BD公司；鼠抗人LAG-3 FITC(17B4)购于美国Lifespan公司。

1.1.3仪器 应用MOFLO XDP流式细胞仪(美国BECKMAN公司) 获取并分析细胞，FlowJo.10.0软件分析流式数据。

1.2实验方法

1.2.1细胞准备 取外周血8～10 ml肝素钠抗凝，在离心管中加入2倍血液体积的淋巴细胞分离液，2 200 r/min离心22 min，然后吸出中间白细胞层加入到装有15 ml RPMI1640的离心管1 800 r/min离心6 min，弃上清，将细胞用1 ml 10%FBS+RPMI1640完全培养基重悬计数，然后每孔以0.2～0.25(106)个淋巴细胞转至96孔平底板中，用地塞米松(109～105mol/L)或10%FBS+RPMI1640完全培养基200 μl/孔处理3 d，流式检测相应细胞标志物。

1.2.2细胞表面染色 按多色分析法进行染色，以1∶1 000比例稀释Livedead，每孔加100 μl稀释好的Livedead，室温30 min避光孵育，染抗体前加5% Fc Receptor Blocking Solution 25 μl/孔，室温培养 5 min，以阻断Fc受体非特异性结合。然后以50 μl/孔的总体系表面染CD3、CD4、CD8、CD127、CD25、LAG-3室温避光30 min，1 800 r/min离心4 min、洗涤，重复3次。

1.2.3Foxp3染色 表面染后根据Foxp3 Perm/Fix试剂盒说明书室温下40 min避光破核膜，3次离心洗涤后染Foxp3抗体。

1.3统计学处理 应用SPSS.20统计软件进行统计学处理，正态分布用t检验，非正态分布用Mann-WhitneyU检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1地塞米松体外短期处理增加CD4+T细胞频率且呈剂量依赖性 为了探讨地塞米松对CD4+T细胞的影响，我们用不同浓度(109～105mol/L)的地塞米松处理健康人外周血淋巴细胞3 d，发现与对照组相比，地塞米松处理后CD4+T细胞的频率显著增高(图1)(P值分别为P=0.058、P=0.009、P=0.006、P=0.02、P=0.003)，且随着浓度的增加均值增大，提示地塞米松增加CD4+T细胞的频率，且呈剂量依赖性。

图1 地塞米松对CD4+T细胞频率的影响(n=10) Fig.1 Effect of dexamethasone on frequency of CD4+T cells(n=10)Note: A.Flow analysis diagram of CD4+T cells；B.The effect of different doses of dexamethasone on CD4+T cells frequency.

图2 地塞米松对CD4+T细胞表型的影响(n=12) Fig.2 Effect of dexamethasone on phenotype of CD4+T cells(n=12) Note: A.Flow analysis diagram of CD4+T cell phenotype；B.The effect of dexamethasone on the expression of CD25，Foxp3，CD127 and LAG-3 on CD4+T cells.

图3 地塞米松影响自然调节性T细胞 (n=10) Fig.3 Effect of dexamethasone on regulatory T cells(n=10)Note: A.Flow analysis diagram of regulatory T cells;B.Dexamethasone reduced the Treg frequency.

图4 地塞米松对Tr1细胞及Tr1/Treg细胞比率的影响(n=8)Fig.4 Effect of dexamethasone on Tr1 and ratio of Tr1/Treg cells (n=8)Note: A.Flow analysis diagram of regulatory Tr1;B.Dexamethasone increase Tr1 frequency;C.The ratio of Tr1/Treg cells increased.

2.2地塞米松体外短期处理改变CD4+T细胞表型 为了明确地塞米松处理后对CD4+T表型影响，我们分析了健康人外周血CD4+T细胞上CD127、CD25、LAG-3和Foxp3的表达情况(图2)，我们发现地塞米松刺激后CD25和 Foxp3显著降低(P值分别为P=0.006和P<0.0001)，而CD127和LAG-3显著升高(P值分别为P<0.0001和P=0.011)，提示地塞米松处理改变CD4+T细胞的表型。

2.3地塞米松体外短期处理影响Treg和Tr1平衡 在本研究中我们发现，与对照组相比，地塞米松处理后Treg频率显著降低，如图3 (P<0.0001)，而Tr1频率增高，如图4(P=0.051)，且Tr1/Treg细胞比率升高(P=0.044)，提示地塞米松改变Tr1/Treg细胞平衡。

3 讨论

本研究发现，地塞米松短期体外处理增加CD4+T细胞频率且呈剂量依赖性，降低CD4+T细胞上CD25和 Foxp3的表达，增加CD127和LAG-3表达；地塞米松处理显著降低Treg，升高Tr1，且Tr1/Treg比率显著增高。糖皮质激素短期处理改变Tr1/Treg细胞平衡。

CD4+辅助性T细胞具有可塑性，可分为多种亚类，包括Th1、Th2、Th17和最近确认的Th9、Th22以及与抗体产生有关的滤泡辅助性T细胞等。另一类具有免疫调节性的CD4+T细胞包括Treg,Tr1等。本研究显示体外地塞米松处理增加CD4+T细胞频率且呈剂量依赖性。Lim[1]发现不同剂量的地塞米松作用效果不一样，低剂量的地塞米松使巨噬细胞功能增加，而大剂量的地塞米松对巨噬细胞功能具有免疫抑制性。陈艳等[19]的研究表明地塞米松对骨形成有抑制作用，且呈剂量依赖性。进一步研究地塞米松对CD4+T细胞的表型影响后发现，CD4+T细胞上的Foxp3和CD25表达显著降低，表明糖皮质激素可能降低Treg频率，结果与Pandolfi等[20]的研究一致。Wang等[18]用地塞米松处理过敏性哮喘小鼠，发现CD4+Foxp3+T细胞在体外实验中增加，而Prado等[21]认为地塞米松增加Foxp3表达，但不增加其调节性活性。本研究还发现地塞米松体外处理后上调CD4+T细胞上CD127和LAG-3的表达,研究结果与Denis和Hai-Chon等一致[22-24]。

通过分析Foxp3和LAG-3分别为Treg和Tr1调节性T细胞典型标志物。地塞米松处理下调Foxp3而上调LAG-3表达，提示地塞米松可能会调节抑制性免疫细胞的平衡。结果分析表明：地塞米松处理后Treg显著降低，Tr1细胞上调，且Tr1/Treg细胞比率显著上调。可能是地塞米松短期处理促进或起始效应性CD4+T细胞分化为以Ⅰ型调节性T细胞为主的调节性T细胞，从而发挥免疫负调控作用。糖皮质激素治疗后的反应性质依赖于刺激的持续时间和免疫系统的生理状态。糖皮质激素在病理状态下起抗炎分子的作用以控制病程；相反，在生理状态下，糖皮质激素可能发挥了促炎作用[25]。这些结果提示，糖皮质激素可能主要诱导Ⅰ型调节性T细胞而发挥免疫调节作用。本研究由于是体外研究探讨糖皮质激素对调节性T细胞数量的影响，具有一定的研究局限性。下一步有必要进一步探讨地塞米松对调节性T细胞增殖与凋亡及功能的影响，并结合不同免疫性疾病对激素治疗前后调节性T细胞分化与功能的研究。

地塞米松对免疫系统的作用是多效性的，且与治疗时间和剂量相关。本研究探讨了地塞米松对调节性T细胞Treg和Tr1的频率及Tr1/Treg平衡的影响。本研究提示在临床进行激素治疗过程中，需明确不同疾病在激素治疗后调节性T细胞的变化及对疾病进展与预后的影响，以便更好地了解激素的临床适应症。

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