早孕绒毛及蜕膜组织中酪氨酸磷酸酶-1/2(SHP-1,SHP-2)与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达及其相关性*

袁 艳 翁宇红 赵淑云 李仕祥 王 珺 谭红梅 杨敏燕 黄官友

(贵州医科大学附属医院，贵阳 550004)

胚胎作为半同种移植物不被母体排斥，是传统免疫理论的一个例外，而妊娠的成功与否，与母胎界面的免疫耐受状态密切相关。母胎界面主要由来自母体的蜕膜组织及来自胚胎的滋养细胞组成。这种特殊的免疫理论成为生殖免疫学界一个热点话题，因此吸引了国内外很多学者来研究母胎界面的免疫耐受调节机制，但是至今，仍未找到确切的机制。

吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase IDO)是肝脏以外唯一可催化色氨酸分解代谢的限速酶，IDO在树突细胞，单核细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞中高表达。研究发现，IDO主要通过降解色氨酸来产生免疫抑制作用[1]。IDO广泛存在于孕早期母胎界面中，并致母胎免疫耐受[2,3]，然而在母胎界面，调节IDO表达的机制尚未阐明。

蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphat-ases，PTPs)家族是一种不含金属酶类，是细胞信号转导中的重要调节因子，主要是通过蛋白质酪氨酸可逆磷酸化参与多种细胞功能的调控。蛋白质酪氨酸磷酸酶-1(Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)和蛋白质酪氨酸磷酸酶-2(Src-homology domain 2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-2)均为含有两个SH2结构域(Src-homology 2 domain)的酪氨酸磷酸酶，是 PTPs 家族重要成员[4]。随着研究逐步深入，包括SHP-1、SHP-2在内的多种PTPs超家族成员作为信号转导的正向调节因子被发现，其在正常细胞的生长分化以及肿瘤细胞的增殖、黏附、转移过程中起着至关重要的作用[4,5]。

本文通过分析早孕绒毛及蜕膜组织中IDO及SHP-1、SHP-2的表达及其相关性，分析SHP-1、SHP-2调节IDO表达的可能性，为探索IDO在母胎界面中免疫耐受的新机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本 选自2014年8月至2017年4月期间在贵州医科大学附属医院计划生育手术室，孕6～9 周正常妊娠妇女行人工流产的绒毛及蜕膜组织。纳入标准是健康妇女正常妊娠30例，妊娠6～9周，妊娠期间未用药物治疗。排除标准是：排除全身性疾病、稽留流产、接受了人流前处理(如孕酮和米非司酮)治疗的妇女。研究经贵州医科大学附属医院伦理委员会批准，且经患者知情同意。

1.1.2主要试剂 蛋白酶抑制剂(P8340)和RIPA缓冲液购自Sigma公司，BCA-100蛋白定量测定制剂盒 、一抗和二抗去除液及三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸电泳液粉剂购自碧云天公司，10×TBST购自Cell Signaling Technology 公司，ECL试剂、PVDF膜、HRP标记山羊抗兔IgG购自PerkinElmer公司，5×SDS-PACE 蛋白上样缓冲液、预染蛋白相对分子质量(Mr)Marker 购自Biosharp 公司，兔抗SHP-1抗体、兔抗SHP-2抗体、兔抗IDO抗体购自Cell Signaling Technology 公司，兔抗GAPDH抗体购自Gnne Tex公司，SDS-PACE制备试剂盒购自索莱宝公司。

1.2方法 相对无菌采集的早孕绒毛和蜕膜用PBS洗涤后，尽量去除红细胞，取出绒毛和蜕膜组织各约100 mg，然后置于已被液氮冷却的研钵中，加入适量液氮碾碎成粉末状后，加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液，充分裂解后，放入4℃离心机中离心30 min，吸取上清液。用BCA测蛋白浓度，加入上样缓冲液后煮沸使其充分变性，将样本加入聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳完成后，通过湿转法将蛋白转至PVDF膜上(转膜条件 120 V,200 mA,90 min)。用5%的脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗4℃过夜，洗膜后加入二抗，孵育50 min，ECL作用3分钟后，使用一体式化学发光成像系统成像。使用Imagel J软件处理图片，GAPDH作为内参对照，结果用目的蛋白条带与内参蛋白条带的吸光度值的比值表示。

1.3统计学方法 数据采用 SPSS19.0软件分析。采用双变量的直线相关性分析和配对t检验进行统计学分析。P<0.05 差异具有统计学意义。

2 结果

2.1IDO在早孕绒毛及蜕膜中的表达 通过Western blot方法检测发现，早孕绒毛和蜕膜中均有IDO蛋白的表达，IDO在蜕膜组织中表达明显高于绒毛组织，差异有统计学意义(t=4.495，P<0.01)，见图1。

2.2SHP-1、SHP-2在早孕绒毛及蜕膜中的表达 Western blot方法检测发现，早孕绒毛和蜕膜中均有SHP-1、SHP-2蛋白的表达。SHP-1、SHP-2在蜕膜组织中表达明显高于绒毛组织，差异有统计学意义(SHP-1表达，t=5.164，P<0.001；SHP-2表达，t=9.764，P<0.0001)； SHP-1、SHP-2在蜕膜组织表达无明显差异(P>0.05)。SHP-1、SHP-2在绒毛组织中表达有明显差异，SHP-1表达明显高于SHP-2的表达，差异有统计学意义(t=4.459，P<0.001)，见图2。

2.3IDO与SHP-1、SHP-2在早孕绒毛和蜕膜中的相关性分析 通过Western blot的结果显示，在GAPDH表达基本一致的情况下，IDO与SHP-1、SHP-2表达呈正相关，通过直线相关分析结果显示，在蜕膜组织IDO与SHP-1、SHP-2呈高度正相关(r=0.924，P<0.01；r=0.955,P<0.01)；在绒毛组织IDO与SHP-1、SHP-2呈高度正相关(r=0.644，P<0.01；r=0.792,P<0.01)，见图3、4。

图1 正常早孕蜕膜(A)和绒毛(B)组织中IDO的表达及半定量分析Fig.1 Expression and semi-quantitative analysis of IDO in chorionic decidua(A)and villi(B) tissus of early pregnancy womenNote: 1-8.Different samples of the patients；A and B.Typical experiment.*. P<0.01.

图2 正常早孕蜕膜(A)和绒毛(B)组织中SHP-1、SHP-2的表达及半定量分析Fig.2 Expression and semi-quantitative analysis of SHP-1,SHP-2 in chorionic decidua(A)and villi(B) tissues of early pregnancy womenNote: 1-8.Different samples of the patients；A and B.Typical experiment.*.P<0.01,**.P<0.001.

图3 蜕膜组织中IDO和SHP-1、SHP-2的表达及相关性分析Fig.3 Expression and correlation analysis of IDO with SHP-1 and SHP-2 in chorionic deciduaNote: Labels 1-7 represent different samples of the patients.A and B represent a typical experiment.

图4 绒毛组织中IDO、SHP-1、SHP-2的表达及相关性分析Fig.4 Expression and correlation analysis of IDO with SHP-1 and SHP-2 in chorionic villiNote: Labels 1-7 represent different samples of the patients.A and B represent a typical experiment.

3 讨论

吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)主要由胎盘滋养细胞和外周血单核-巨噬细胞分泌，且有研究发现,妊娠时IDO在胎盘中高表达[3]。最初研究 IDO 致免疫耐受(母体耐受)是在 1998 年，Munn等[6]发现 IDO 抑制剂处理的孕鼠能迅速引起针对同种异基因孕体的排斥反应，揭示在正常妊娠中，IDO是免疫耐受调节和维持妊娠的关键因素。用免疫组化方法发现，在早期或晚期胎盘组织的合体滋养细胞和内皮细胞中，IDO 呈中度表达，而伸入蜕膜内，与母体免疫系统紧密接触的侵入性绒毛膜外滋养细胞则高度表达 IDO[7，8]。本研究结果表明，在早孕蜕膜及绒毛组织中均高表达IDO，IDO在蜕膜组织中的表达高于绒毛。推测在母胎界面中绒毛是发育胎儿的部分，因此在绒毛中参与免疫调节的因子较少，免疫功能也相对较弱，而蜕膜是即将发育为胎盘的部分，在以后的妊娠中是母体和胎儿的重要连接部分也是母胎界面的重要组成部分，故免疫调节功能较强。在母胎界面高表达的IDO可能通过下调局部 T 细胞介导的免疫应答来保护胎儿免受母体的免疫排斥反应[2]。

本研究结果揭示，酪氨酸磷酸酶-1/2(SHP-1，SHP-2)在早孕蜕膜及绒毛组织中均高表达，在蜕膜组织中表达高于绒毛组织。研究发现IDO非催化亚单位含有两个功能性的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIMs)[9]。2011年，Pallotta等[10]在培养的DCs或浆细胞样树突状细胞 (pDC)中发现，IDO分子上的

ITIM 磷酸化后与SHPs形成IDO/SHPs 复合物，IDO/SHPs 复合物通过抑制IL-1受体相关激酶-1(IL-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1) 活化抗炎症NF-κB 通路 (p52/RelB)；活化的p52/RelB 诱导Ⅰ型 IFN(IFNα/β)及TGF-β的表达；最终，活化的p52/RelB、IFNα/β及TGF-β均可上调IDO表达，而活化的TGF-β通过诱导SHPs的表达而上调IDO的表达。我们在人早孕绒毛及蜕膜组织中发现TGF-β可上调IDO表达(资料未发表)，并发现IDO与SHP-1、SHP-2呈正相关，与Pallotta等的报道一致。推测在母胎界面，SHP-1、SHP-2可能参与正性调节IDO表达。

总之，本研究分析IDO与SHP-1、SHP-2在绒毛及蜕膜组织中表达及其相关性，提示SHP-1和SHP-2可能通过调节IDO的表达，参与IDO在母胎界面的免疫调节。

参考文献：

[1] Orabona C,Grohmann U.Indoleamine 2,3-dioxygenase and regulatory function:tryptophan starvation and beyon[J].Methods Mol Biol，2011,677:269-280.

[2] Huang G,Zeng Y,Liang P,etal.Indoleamine 2,3-Dioxygenase (IDO) downregulates the cell surface expression of the CD4 molecule[J].Int J Mol Sci,2012,13(9):10863-10879.

[3] Sedlmayr P.Indoleamine 2,3-dioxygenase in materno-fetal interaction[J].Curr Drug Metab,2007,8(3):205-208.

[4] Hale AJ,Ter Steege E,den Hertog J.Recent advances in understanding the role of protein-tyrosine phosphatases in development and disease[J].Dev Biol,2017,428(2):283-292.

[5] Mustelin T,Vang T,Bottini N.Protein tyrosine phosphatases and the immune response[J].Nat Rev Immunol,2005,5(1):43-57.

[6] Munn D H,Zhou M,Attwood J T,etal.Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism[J].Science,1998,281(5380):1191-1193.

[7] Hönig A,Rieger L,Kapp M,etal.Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) expression in invasive extravillous trophoblast supports role of the enzyme for materno-fetal tolerance[J].J Reprod Immunol,2004,61(2):79-86.

[8] Liu W，Huang Y，Huang G,etal.Relationship of SOCS3 and TGF-β with IDO expression in early pregnancy chorionic villi and decidua[J].Exp Therap Med,2017,14:4817-4824.

[9] 王 丹，张军平.吲哚胺2，3-双加氧酶对免疫系统双向调节作用的研究进展[J].中国免疫学杂志，2014,30(4):566-569.

Wang D，Zhang JP.Progress of bidirectional regulation of immune system by indolamine 2,3-dioxygenase[J].Chin J Immunol,2014,30(4):566-569.

[10] Pallotta M T,Orabona C,Volpi C,etal.Indoleamin 2,3-dioxygenase is a signaling protein in long-term tolerance by dendritic cells[J].Nat Immunol,2011,12(9):870-878.