PI3K/Akt通路调节LPS诱导的小胶质细胞内HSPA12B表达*

王 萍

(绍兴市人民医院，绍兴 312000)

小胶质细胞(Microglia,MG)是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)中天然免疫和适应性免疫的主要效应细胞。小胶质细胞的激活在神经退行性疾病的病理发生过程中发挥了重要的作用，参与多种神经退行性疾病进程，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病和多发性硬化症等[1,2]。HSPA12B 是最近发现的HSP70 家族的新成员，与该家族其他成员相比较，有着自己特异的结构和功能[3]。在CNS应激过程中，HSPA12B发挥保护作用，可抑制神经细胞凋亡，维持血脑屏障通透性，减少脑缺血缺氧梗死面积等[4,5]。课题组已报道了HSPA12B作为炎症反应蛋白在CNS炎症过程中表达上调，参与小胶质细胞的炎性活化过程[8]。据报道，磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白kinase B(PI3K/Akt)途径参与HSPA12B神经保护作用的调节[5]。PI3K/Akt信号通路通过激活下游的NF-κB和GSK-3β/cyclin D1促进小胶质细胞的活化和增殖[6,7]。本研究旨在评价PI3K/Akt途径在小胶质细胞炎性活化过程对HSPA12B表达的影响，为探讨HSPA12B在CNS炎症病程中功能的可能调节机制提供基础。

1 材料与方法

1.1主要试剂及来源 HAPI大鼠小胶质细胞由南通大学沈勤教授惠赠。DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibco);LPS、TritionX-100(Sigma)。主要抗体抗HSPA12B多克隆抗体(Sigma);Akt、 phosphor-Akt (p-Akt)(Cell Signal);GAPDH、FITC Goat anti rabbit、Hoechst(Santa cruz)。

1.2方法

1.2.1细胞分组培养 细胞加入RPMI1640培养基(含100 U/ml青霉素、10 μg/ml链霉素、10 mmol/L-谷氨酰胺及10%小牛血清)于37℃、 5%CO2培养箱培养。细胞达到80%融合时换成无血清的RPMI1640培养基培养24 h后进行实验。

将处于对数生长期的小胶质细胞随机分为3组：①空白对照组。②LPS单一刺激组：取LPS终浓度均为0.1 μg/ml，刺激后继续培养时间分别为2、4、6、8、12、24 h。③LY294002预处理1 h，再用LPS终浓度均为0.1 μg/ml刺激2 h组。

1.2.2Western blot 收获各组培养细胞，1 ml 0.01 mol/L 预冷的 PBS刮下细胞。4℃，1 000 r/min离心15 min，弃上清。2×SDS蛋白裂解液溶解细胞沉淀，震荡混匀后冰浴20 min。沸水煮10 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清。蛋白质行10%SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.6，150 mmol/L NaCl，0.5%Tween 20)洗涤3次，兔抗Ab4112多克隆抗体室温孵育1 h，4℃过夜，TBST洗涤3次，HRP-标记的山羊抗兔抗体室温孵育1 h，TBST洗涤3次，用ECL(pierce)进行检测，柯达胶片曝光显影。

1.2.3免疫荧光细胞化学 HAPI细胞种到盖玻片上，贴壁后用1 μg/ml LPS刺激2 h，4%多聚甲醛，室温固定1 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加封闭血清，室温2 h。吸去封闭血清，加入一抗混合液：兔抗大鼠Ab4112多克隆抗体(1∶100)，室温孵育1 h后4℃孵育过夜。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加入二抗混合液： FITC偶联的山羊抗兔IgG(1∶200)，Hoechst(1∶200)，避光，4℃孵育 1 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次。荧光封片剂封片后荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1LPS诱导的小胶质细胞中HSPA12B的表达 用0.1 μg/ml LPS分别作用 0、2、4、6、8、12、24 h。经不同时间刺激，HSPA12B的表达量不同。刺激2 h 后HSPA12B 蛋白表达开始增加，8 h后逐渐降至正常水平(见图1)。

2.2LPS诱导小胶质细胞中PI3K/Akt的磷酸化 用0.1 μg/ml LPS分别作用 0、 2、 4、6、8、12、24 h。经不同时间刺激，磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达量增加。刺激2 h后 p-Akt开始增加，6 h达到峰值，8 h 后逐渐降至正常水平(见图2)。

图1 不同作用时间的LPS对小胶质细胞中HSPA12B蛋白表达的影响Fig.1 Effects of different stimulation terms of LPS on HSPA12B protein in microgliasNote: *.P<0.05,vs control.

图2 不同作用时间的LPS对小胶质细胞中Akt磷酸化蛋白表达的影响Fig.2 Effects of different stimulation terms of LPS on protein levels of phosphorylated Akt in microgliasNote: *.P<0.05,vs control.

图3PI3K/Akt通路参与了LPS诱导的HSPA12B表达

Fig.3EffectsofPI3K/AktsignalingpathwayonLPS-inducedHSPA12Bproteinlevelsinmicroglias

Note: A.The effect of PI3K/Akt inhibitor LY294002 on the expression of phosphorylated Akt；B.The effect of LY294002 on the expression of HSPA12B；C.Quantitative analysis of the expressions of phosphorylated Akt and HSPA12B.*.P<0.05,versus the corresponding control；D.Immunocytochemical staining indicated that LY294002 could effectively inhibit the expression of HSPA12B induced by LPS in the cells.bar:10 μm.

2.3PI3K/Akt通路参与调节LPS诱导的小胶质细胞中HSPA12B的表达 应用PI3K/Akt特异的药理抑制剂LY294002预处理小胶质细胞1 h，再用LPS终浓度均为1 μg/ml刺激2 h组。检测PI3K/Akt通路的激活在LPS诱导HSPA12B表达中的作用。LY294002(10、50 mmol/L)以浓度依赖方式不同程度抑制LPS诱导的HSPA12B的表达(见图3A～C)。

免疫荧光染色显示，应用特异的药理抑制剂LY294002(10 mmol/L)，可显著抑制LPS诱导的HSPA12B的表达增加。上述结果提示在LPS诱导HSPA12B表达的过程中，PI3K/Akt通路发挥了极其重要的作用(见图3D)。

3 讨论

LPS作为小胶质细胞刺激因子，已经被大量用来研究AD与PD等病理发生发展过程中的炎症进程，为之后的抗炎治疗提供理论依据。在本研究中，我们报道了PI3K/Akt途径参与调控LPS诱导小胶质细胞HSPA12B表达。 LPS 0.1 μg/ml作用后，HSPA12B在2 h表达增加，表达活性最高；同时Akt的磷酸化水平增强，应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理小胶质细胞，显著抑制了LPS诱导HSPA12B蛋白水平的表达。

小胶质细胞是常驻CNS的单核吞噬细胞家族成员之一，具有免疫和炎症双重功能。在LPS诱导的细胞因子应答过程中，小胶质细胞发生活化，通过炎症放大和神经元损失参与CNS神经退行性变[9]。HSPA12B 是最近发现的HSP70 家族的新成员。HSP70在CNS应激过程中高表达，这一现象被认为与炎症过程中HSP70的神经元保护作用密切相关[10]。文献报道了过表达HSPA12B，能显著缩小MCAO引起的脑梗塞面积，显著减轻海马神经元损伤。在LPS诱导的炎症过程中，HSPA12B的保护性作用也得到验证，HSPA12B参与内皮细胞的炎症反应，过表达HSPA12B可以减弱血管内皮细胞的炎性反应，从而保护心脏功能和抑制炎症因子的合成[11]。本课题组曾首次报道HSPA12B 作为炎症反应蛋白参与CNS的炎症进程，参与小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，调节LPS活化的星形胶质细胞中炎症因子(TNF-α、IL-1β)的表达[12]。LPS活化小胶质细胞，PI3K/Akt发生磷酸化增强。PI3K/Akt信号通路通过激活下游的NF-κB和GSK-3β/cyclin D1促进小胶质细胞的活化和增殖。PI3K/Akt途径参与介导HSPA12B的保护性作用过程：介导HSPA12B的心脏保护作用；调节HSPA12B诱导的内皮细胞迁移；参与HSPA12B在脑缺血损伤中的抑制神经细胞凋亡与脑缺血/脑保护再灌注损伤[13,14]。本研究通过抑制PI3K/Akt通路，检测对LPS诱导的小胶质细胞活化过程中HSPA12B表达的影响。应用PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002预处理小胶质细胞，LPS诱导的HSPA12B的蛋白表达受到显著抑制，细胞免疫荧光也显示，细胞核内表达明显减弱。实验结果表明，PI3K/Akt途径参与调节LPS诱导活化的小胶质细胞中HSPA12B的表达。

综上所述，HSPA12B作为炎症反应蛋白参与小胶质细胞活化过程，PI3K/Akt信号通路参与调节小胶质细胞炎性活化中HSPA12B的表达。这为进一步探讨HSPA12B在小胶质细胞炎症过程中的作用及机制，为CNS神经炎症的治疗寻找新的炎症干预靶点提供基础。

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