低场核磁共振技术测定石花菜对酸奶水分迁移及超微结构的影响

林圣楠，李天骄，田永奇，陈雅霜，李梦娇，朱 丰，林向阳*

（福州大学 生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

水分是酸奶的重要成分，水分的存在状态对于酸奶产品质量的好坏起到了重要的作用。酸奶发酵和储藏过程其实就是水与蛋白质大分子和钙等物质相互作用的过程，这一过程涉及水分存在状态的变化、水分的分布与迁移、水分与蛋白质的结合与解析等[1-3]。近年来，国内外对于低场核磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）测定奶制品的报道不绝于耳，但对石花菜酸奶中水分迁移特性及微结构的研究罕见报道。万婕[4]采用核磁共振技术研究发酵及储藏过程中酸奶的水分变化。结果表明，经高压处理的膳食纤维酸奶持水性更强，乳清不易析出。王兆龙[5]将核磁共振技术应用在抗性淀粉酸牛奶中，结果表明，酸奶pH值与结合较紧密的水分子质子密度线性相关。HINRICHSR等[6]利用核磁共振考察酸奶凝胶体系。LUCAST等[7]利用核磁共振评价配方中乳化剂的性质、蛋白质对脂肪的影响并通过测量横向弛豫时间和纵向弛豫时间来研究液态和冷冻条件下的冰淇淋，此方法论证了在冷冻状态下核磁共振依然可以测定氢质子的结合状态。BOTLAN D L等[8]通过对比示差扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）和低场核磁共振及其核磁成像技术（magnetic resonance imaging，MRI）测量乳脂肪固相脂肪指数比发现，NMR比DSC造成的误差更低。DEAN RL等[9]将差示扫描量热法与核磁共振结合，考察奶中氢质子分布结合情况，结果表明，两种方法相结合使不同的水-蛋白质的反应的区分更明显。

利用核磁共振技术在食品研究上的优势，研究石花菜酸奶的弛豫参数，从而分析对比其与酸奶在发酵及储藏过程中的水分状态、水分迁移及水分分布具有重大意义。本实验利用低场核磁共振及其成像技术对比了石花菜酸奶发酵及冷藏后熟过程的水分迁移特性，从分子角度阐述了添加石花菜对酸奶水分迁移的影响；并采用环境扫描电镜对石花菜酸奶和酸奶的超微形貌特征进行观察分析，从微观角度分析了影响酸奶结构及持水特性的因素。本试验采用低场核磁共振技术测定石花菜酸奶加工以及储藏过程中弛豫时间和质子密度的变化，结合核磁共振成像（MRI）获得酸奶在各过程中高清晰度图像，并采用环境扫描电镜（environment scanning electron microscope，ESEM）对石花菜酸奶超微形貌特征进行观察分析，以确定酸奶最佳发酵时间及冷藏后熟时间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石花菜：青岛海悠悠商贸有限公司；高蛋白脱脂高钙奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；白砂糖（食品级）：厦门古龙食品有限公司；HOWARU乳双歧杆菌HN019：杜邦丹尼斯克公司；厌氧产气袋、圆底立式培养袋、氧气指示剂：青岛雅各化学试剂销售有限公司。

1.2 仪器与设备

CJM-SC-A型高能纳米冲击磨：秦皇岛太极环纳米制品有限公司；MINIMR核磁共振分析仪（23 MHz，0.56 T）：上海纽迈电子科技有限公司；FM200实验室高剪切分散乳化机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器；昆山市超声仪器有限公司；BC/BD-217CH冷柜：河南新飞电器有限公司；BS110S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；VF-12型广州汇利醒发箱：佛山市南海港洋机电设备有限公司；XL30 ESEM-TMP型环境扫描电镜：荷兰Philips-FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 石花菜酸奶的制备

石花菜的前处理：将干净的石花菜经高能纳米冲击磨粉碎得到石花菜粉末，然后在石花菜粉中加入蒸馏水，在90℃、80 kHz条件下超声120 min，充分浸提出石花菜中的营养成分，并趁热抽滤得石花菜琼胶溶液[10]。

以蔗糖添加量11%、石花菜琼胶溶液添加量20%、双歧杆菌接种量1.5%，于高蛋白脱脂高钙奶粉配制的浓度为12.5%的复原乳中，并置于45℃恒温培养箱中发酵，4℃条件培养冷藏后熟24 h[10]。利用核磁共振技术分别测定发酵0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h时石花菜酸奶中的水分迁移行为。

1.3.2 酸奶的制备

以蔗糖添加量11%、双歧杆菌接种量1.5%于高蛋白脱脂高钙奶粉配制的浓度为12.5%的复原乳中，并置于45℃恒温培养箱中发酵，4℃条件培养冷藏后熟24 h。利用核磁共振技术分别测定发酵0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h时酸奶中的水分迁移行为。

1.3.3 核磁共振试验及其参数设定

称取约2.500 g样品放入玻璃试管（口径18 mm），而后将样品管置于NMR探头中（保持温度32℃），使用CPMG序列测试横向弛豫时间T2，其中接收机带宽是SW=200 kHz，采样起始点控制参数RFD=0.080 ms，重复采样时间间隔TW=4 000.000 ms，模拟增益RG1=20.0 db，90°和180°脉宽分别是P90=20.00μs，P180=39.00μs，采样点数TD=207 830，数字增益DRG1=3，数据半径DR=1，累加扫描次数NS=8，回波个数NECH=5 000。试验测3份平行。

反演所得的图谱获得弛豫时间T2和质子密度M2。弛豫时间T2表征水分流动性大小，当弛豫时间T2越大，水流动性越大，水分结合越松，质子密度M2表征弛豫时间下水分的含量[11-14]。

1.3.4 低场核磁共振测定核磁共振成像试验及参数设定

采用多层自旋回波序列（multi-slice echo，MSE）进行质子加权成像，Y轴为选层梯度，X轴为相位梯度，Z轴为读出梯度，90°和180°软脉冲均为1 200μs，重复采样时间D0为1 000.000 ms，半回波时间D4为0.100 ms，选层梯度脉冲（90°）对应的补偿梯度GA1为13.5%，选层梯度脉冲（180°）对应的补偿梯度脉冲GA2为80.0%，相位编码脉冲的幅度GA3为35.0%，频率编码方向的补偿梯度脉冲的幅度GA4为57.0%，频率编码脉冲的幅度GA5为30.0%[11-14]。

1.3.5 环境扫描电镜试验及参数设定

取一定量酸奶、石花菜酸奶样品置于-18℃冷柜中预冻7 h，后置于-80℃超低温冰箱中冷冻4 h，取出后立即冻干24 h。再将冻干后的样品喷金，抽真空后在15.0 V加速电压下进行扫描电镜测试[15]。

1.3.6 样品数据分析

实验采用Excel软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 石花菜酸奶核磁共振分析

本课题利用核磁共振仪对酸奶及石花菜酸奶发酵及货架期的自旋-自旋弛豫时间进行测定，结果见图1。由图1可知，软件拟合后得到2个峰。酸奶横向弛豫时间范围T21（57.223 68～75.646 33 ms）较小，质子密度M21也较小，说明T21水分子可能是形成网络结构孔隙中所束缚的不易流动的水，氢键结合力度较强，也可能是与蛋白质等大分子结合较紧密的那部分水，横向弛豫时间范围T22（200.923 3～464.158 88 ms）比T21高，且质子密度M22也较高，说明T22水分子结合较为疏松，流动性较高[16-20]。由峰比例可以看出，T21与T22的峰比例为0.015 39∶0.984 6，T21结果不显著（P＞0.05），因此，以研究T22峰面积变化为主。以T22及该组分水对应的质子密度M22为主要指标，结合质子密度成像结果和环境扫描电镜成像分析酸奶发酵凝乳结构的变化，对石花菜酸奶和酸奶水分迁移特性进行比较。

图1 石花菜酸奶横向弛豫时间分布Fig.1 Transverse relaxation time distribution of Gelidium amansii yoghurt

2.2 不同发酵时间石花菜酸奶及酸奶的核磁共振数据变化

酸奶发酵后水分子与蛋白质分子交联形成凝胶空间网络结构。发酵及贮藏时间是决定酸奶品质的关键因素，时间过短，乳酸产生较少，pH尚未降低到等电点，酪蛋白未能完全解离与疏水键、氢键和静电斥力等形成三维凝胶网状结构，造成酸奶胶黏性降低，未能形成凝乳结构。而发酵时间过长，菌利用营养物质后产生代谢产物累积，造成酸环境紊乱，凝胶结构被破坏，酸奶分层，乳清析出。所以，探索酸奶最适发酵时间具有重要意义，不同发酵及贮藏时间酸奶的横向驰豫时间结果见图2。由图2可知，两种酸奶横向弛豫时间T22总体都是先增加后减少。这可能是因为发酵过程使得酸奶体系组分迁移，水分流动性增加。奶中的酪蛋白胶束解离后利用疏水键、氢键和静电斥力等形成三维凝胶网络，因此水分子在水与水之间的快速交换含蛋白质和游离水，酸奶体系组分迁移，促使之前与蛋白质等大分子结合较紧密的组分获得一定流动性[11-14]。当酸奶冷藏后期，弛豫时间降低，主要是因为形成凝乳网络，大部分自由水被束缚在凝胶网络微孔中，水分流动性减小，持水性增强。

图2 酸奶发酵时间对横向弛豫时间T22的影响Fig.2 Effect of yogurt fermentation time on transverse relaxation time T22

由图2可知，石花菜酸奶在0～6 h前横向弛豫时间总体大于不添加石花菜发酵的酸奶，而6～48 h时，石花菜酸奶的横向弛豫时间反而小于酸奶，24 h趋于稳定。发酵初始，由于添加了石花菜琼胶热溶液与复原乳混合，水分流动性增加，而在发酵过程中，水分子与琼脂中的疏水主链通过氢键结合，石花菜琼胶溶液从双螺旋结构逐渐形成三维网状的凝胶结构，形成琼脂聚合物。蛋白质酪蛋白胶束与琼胶分子间相互缠结形成网络节点，三维网状凝胶结构结合更加紧密，因此添加石花菜琼胶的酸奶具有较高的持水能力，体系水分流动性较低。贮藏阶段，酸奶的横向弛豫时间略微增大，主要是由于分子间氢键断裂，同时凝乳的结构被破坏导致与大分子结合的水分游离出来，乳清析出，流动性变强，这同时也说明了添加石花菜琼胶有利于酸奶的持水性和稳定性[11-14]。因此，发酵6 h时达到最佳状态，此时横向弛豫时间最大。24 h时石花菜酸奶横向弛豫趋于稳定，将发酵24 h的石花菜酸奶取出用于后续实验。

为进一步分析在不同发酵时间条件下酸奶持水能力的变化，以T22组分的质子密度M22作为对象进行研究，结果见图3。

图3 不同酸奶发酵时间对质子密度M22的影响Fig.3 Effect of different yogurt fermentation time on proton density M22

由图3可知，随着发酵时间的延长，质子密度M22逐渐下降，说明持水性增加。这可能是因为酸奶在发酵过程中，牛乳中的酪蛋白形成三维凝胶网络，流动性较大的水分子束缚在网络结构的孔隙中，降低了水分流动性，增加持水性。而酸奶质子密度M22在48 h时略微增加，可能是因为酸奶体系中形成的蛋白质胶体结构被破坏，乳清析出，造成体系水分流失[11]。

由图3还可看出，添加石花菜琼胶发酵的酸奶水分含量逐渐高于不添加石花菜琼胶的酸奶，这是因为石花菜琼胶与牛乳酪蛋白的相互作用，石花菜琼胶通过双螺旋结构的羟基与相邻的螺旋或水分子进行氢键结合，凝胶三维网络结构更为紧密。流动性较大的水分子被包裹在三维网状凝胶结构内部，内部的氢键束缚住更多自由水，增强稳定性，提高持水性，降低流动性。

2.3 石花菜酸奶及酸奶核磁共振成像结果

石花菜酸奶和酸奶在发酵24 h时的MRI质子密度成像结果见图4，质子密度越大则图像越亮，代表此部分水分分布越多。由图4可知，石花菜酸奶样品成像区域亮度比酸奶亮，即含水量比酸奶多，持水性更好。由MRI结果直观地监测到水分分布状态，石花菜酸奶较亮，水分含量较多，说明加入了石花菜琼胶使得水分被凝胶结构所包围，使得水分不游离出来。而酸奶样品周围较暗，说明水分分布从酸奶表面流失，乳清析出，分子间氢键断裂，凝乳的结构被破坏，与大分子结合的水分部分游离出来，图像亮度较暗[21]。

图4 石花菜酸奶（a）及酸奶（b）的质子密度成像结果Fig.4 Results of proton density images of Gelidium amansii yogurt(a)and yogurt(b)

2.4 环境扫描电镜成像结果

实验对石花菜琼胶、发酵24 h的酸奶、石花菜酸奶取样并在环境扫描电镜进行测试，观察酸奶的微观结构，酸奶、石花菜琼胶、石花菜酸奶的微观结构见图5。由图5可知，将石花菜琼胶添加到高蛋白低脂高钙复原乳中发酵的酸奶，凝胶过程中，蛋白质酪蛋白胶束与琼胶分子间相互缠结，蛋白链球颗粒粘结在致密的琼胶网络结构之中交联形成网状结构。电镜成像结果与弛豫特性测定结果相一致，添加石花菜琼胶发酵，琼胶结构致密，与蛋白链球充分粘结在一起形成一个整体，蛋白颗粒交联形成网络结构，此阶段为石花菜酸奶发酵完成阶段[22]。

图5 环境扫描电镜成像结果（×10 000）Fig.5 Results of environment scanning electron microscope images(×10 000)

3 结论

利用低场核磁共振仪中CPMG序列测定石花菜酸奶及酸奶的横向弛豫时间T2，经软件拟合后共得到两个组分的峰，它们代表酸奶中流动性不同的水分，分别为结合较为紧密的水T21（57.223 68～75.646 33 ms）和流动性较大的水T22（200.9233～464.15888ms）。以质子密度M22为主要指标，结合成像结果，研究酸奶在发酵及储藏过程中的水分迁移及水分状态变化，发现石花菜酸奶的水分含量变化幅度小于酸奶，说明了添加石花菜琼胶的酸奶持水性更强。确定了最优发酵时间为6h，后熟时间为24h。通过环境扫描电镜技术分析发现添加石花菜琼胶发酵的酸奶，其蛋白质酪蛋白胶束与琼胶分子间相互缠结，蛋白链球颗粒粘结在致密的琼胶网络结构之中，持水性提高，与核磁共振分析结果一致。

参考文献：

[1]MULAS G,ROGGIO T,UZZAU S,et al.A new magnetic resonance imaging approach for discriminating Sardinian sheep milk cheese made from heat-treated or raw milk[J].J Dairy Sci,2013,96(12)：7393-7403.

[2]王兆龙.核磁共振技术在抗性淀粉酸牛奶中的应用[D].南昌：南昌大学，2012.

[3]苗志英，夏 天，陈珊珊，等.基于单边核磁共振技术的乳制品品质分析[J].食品科学，2016，37（22）：155-159.

[4]万 婕.豆渣膳食纤维动态超高压微射流改性过程中超分子结构变化与性质的关系研究[D].南昌：南昌大学，2009.

[5]王兆龙.核磁共振技术在抗性淀粉酸牛奶中的应用[D].南昌：南昌大学，2012.

[6]HINRICHSR,GÖTZ J,WEISSERH.Water-holding capacity and structure of hydrocolloid-gels,WPC-gels and yogurts characterised by means of NMR[J].Food Chem,2003,82(1)：155-160.

[7]LUCAST,WAGENERM,BAREY P,et al.NMRassessment of mix and icecream.Effect of formulation on liquid water and ice[J].Int Dairy J,2005,15(10)：1064-1073.

[8]BOTLAND L,HELIE-FOUREL I.Assessment of the intermediate phase in milk fat by low-resolution nuclear magnetic resonance[J].Anal Chim Acta,1995,311(2)：217-223.

[9]DEAN A L,MARIETTE F,LUCAST,et al.Assessment of the state of water in reconstituted milk protein dispersions by nuclear magnetic resonance(NMR)and differential scanningcalorimetry(DSC)[J].LWT-Food Sci Technol,2001,34(5)：299-305.

[10]朱 丰，刘施琳，李天骄，等.响应面法优化石花菜酸奶发酵工艺研究[J].中国酿造，2017，36（4）：103-108.

[11]肖昌贵.红曲酸奶发酵工艺及其品质研究[D].福州：福州大学，2014.[12]万 婕，刘成梅，刘 伟，等.核磁共振技术研究膳食纤维酸奶发酵及储藏过程中的水分迁移行为[J].食品科技，2009（5）：74-76.

[13]WU J,LIL L,WU X Y,et al.Characterization of Oat(Avena nuda L.)β-glucan cryogelation processby low-field NMR[J].J Agr Food Chem,2016,64(1)：310-319.

[14]HILLSB P.Applicationsof low-field NMRto food science[J].Ann Rep NMR Spectr,2006,58(5)：177-230.

[15]陆 婧.藏灵菇酸奶及酸奶粉的制作工艺优化[D].兰州：甘肃农业大学，2013.

[16]程一鑫，张锦胜，王兆龙，等.低场NMR研究抗性淀粉对酸牛奶在贮藏过程中持水性的变化[J].食品工业科技，2013，34（10）：93-96.

[17]林向阳.核磁共振及成像技术在面包制品加工与储藏过程中的研究[D].南昌：南昌大学，2006.

[18]林向阳，陈卫江，何承云，等.核磁共振及其成像技术在面团形成过程中的研究[J].中国粮油学报，2006，21（6）：163-167.

[19]陈卫江，林向阳，阮榕生，等.核磁共振技术无损快速评价食品水分的研究[J].食品研究与开发，2006，27（4）：125-127.

[20]彭树美，林向阳，阮榕生，等.核磁共振及成像技术在食品工业中的应用[J].食品科学，2008，29（11）：712-716.

[21]林向阳，RUANR，CHENP，等.食品中核磁共振状态图的应用（英文）[J].食品科学，2004，25（10）：91-94.

[22]陈 臣，郭本恒.核磁共振技术在乳制品研究中的应用[J].中国乳品工业，2007，35（7）：32-36.