响应面法优化异常毕赤酵母（Pichiaanomala）0732-1抑菌产物发酵条件

马小莉，王晓东*

（石河子大学 农学院 绿洲农作物病害防控重点实验室，新疆 石河子 832000）

异常毕赤酵母（Pichiaanomala）为子囊菌门异宗配合的酵母，单细胞，属于非酿酒酵母，其分布十分广泛。P.anomala的生长温度范围在3～37℃、pH范围为2～12，可以耐受低pH值、低水活度、高渗透压、厌氧等极端环境[1]。基于以上原因，P.anomala以其独有的生理特性及作为一种对人类、环境安全的拮抗微生物而广泛应用在生物防治中。

瓜类细菌性果斑病是发生在葫芦科植物上的一种严重的检疫性病害，是一种具有高度破坏性的种传病害，其病原菌为瓜类果斑病菌（Acidovorax citrulli）（Aac），可以侵染多种葫芦科作物如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等[2-4]。目前，生产上对该病害的防治主要采用化学防治方法。但据研究显示，生产上常用的化学药剂对细菌性果斑病的防治效果都不理想[5]。频繁使用化学杀菌剂，不仅易使病菌产生抗药性，而且影响环境安全和人体健康。然而，生物防治具有无污染、无公害、不产生抗药性，长效等优点，因此，在农业和经济发展方面，利用P.anomala 0732-1对病害进行生物防治具有重要意义。WANGX D等[6]研究发现，P.anomala 0732-1对哈密瓜细菌性果斑病具有良好生防效果，并发现该菌株能产生对病原具有抗生作用的有机酸类物质。据陈好娟[7]研究发现，通过不同检测方法明确P.anomala 0732-1上清液中抑菌物质的主要组分有：乙酸、丙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸。乙酸含量最高，其次为琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸，丙酸含量最少。

目前，有关P.anomala0732-1发酵条件及抑菌效果的研究尚处起步阶段，国内外暂无相关研究结果。在课题组前期完成了培养基优化和单因素试验基础上，本试验对P.anomala 0732-1抑菌产物发酵条件进行优化研究，并对其产物进行抑菌效果测定，以期为后期规模化发酵生产及其实践应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

异常毕赤酵母（Pichia anomala）0732-1和瓜类果斑病菌（Acidovorax citrulli）XJ05-1（Aac）由石河子大学农学院植保系王晓东提供。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、金氏培养基B（King's B agar，KBA）：参照文献[8]制备；优化培养基：参照文献[7]制备。

1.2 仪器与设备

UV-1600紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；DNP-9162型电热恒温培养箱：上海精宏试验设备有限公司；ZWY-211B型恒温振动摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；MLS-3750型高压灭菌器：日本三洋公司；FE20型pH计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；5417R型台式冷冻离心机：德国Eppendorf公司；SW-CJ-1C型超净工作台：苏净集团安泰公司；XB.K.25型纽鲍尔血球计数板：上海市求精生化试剂仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化制备

异常毕赤酵母（P.anomala）0732-1活化：用接种环挑取试管中保存的酵母菌株划线（接种方式）于PDA平板上，经28℃活化36 h。用无菌水清洗菌苔，洗液装入2 mL离心管，4℃、10 000 r/min离心5 min，重复2次，借助纽鲍尔血球计数板配制浓度为1×108CFU/mL的酵母悬浮液，备用。

瓜类果斑病菌（A.citrulli）XJ05-1（Aac）活化：Aac在KBA平板上于28℃活化48 h，用无菌水清洗菌苔，菌液装入2 mL离心管，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，重复2次，用无菌水悬浮菌体，借助紫外-可见分光光度计将菌悬液的浓度调整到1×108CFU/mL（OD600nm值=0.3～0.4），备用。

1.3.2 抗菌物质抑菌效果的测定

P.anomala0732-1所产生短链有机酸是其生防机制的关键因子，采用琼脂孔扩散法测定抑菌圈直径[9]。吸取1 mL浓度为1×108CFU/mL（OD600nm=0.3～0.4）的Aac菌悬液加入KBA平板，使Aac菌悬液布满全皿，吸出多余菌液，无菌条件下，晾干培养基表面的水分。用直径为7 mm无菌打孔器打孔，吸取100μL样品注入孔中，将培养皿置于28℃恒温生化培养箱中培养48 h后，用十字交叉法测量抑菌圈的直径，每个处理3次重复。

1.3.3 Plackett-Burman试验

Plackett-Burman（PB）试验设计广泛用于因素主效应的估计[10]，是一种近饱和的二水平试验设计方法，能以最少试验次数快速筛选出对应变量影响显著的几个因素，以供进一步研究。本试验选取5个影响因素作为研究对象，PB试验设计表选用5因素，N=12次的试验表格，每组试验做3个平行，取平均值。分析试验结果，比较各因素对酵母菌抑菌效果的影响。具体试验因素和水平参见表1。

表1 Plackett-Burman试验因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.4 最陡爬坡试验设计

在响应面设计中，为建立有效的响应面拟合方程，使所选各个因素的水平必须逼近最大抑菌区域，因此，必须进行最陡爬坡试验[11]。根据PB试验结果中各个显著影响因素效应的大小来设定步长及变化方向，找出峰值，快速逼近最佳值区域。

1.3.5 BBD试验设计

通过最陡爬坡试验逼近最佳范围后，采用响应面分析法中Box-Behnken设计（Box-Behnken Design，BBD）法[12-13]，对其关键因子进行深入研究。根据爬坡试验结果，利用Design Expert 8.0.6软件对主要影响因素进行3因素3水平响应面分析设计。每个试验重复3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 PB试验筛选主要影响因子

在前期试验室相关研究成果的基础上，选用试验次数N=12的PB试验设计对培养液初始pH值、接种量、温度、培养时间和装样量（150 mL三角瓶）5个因素进行考察，表1中X1、X2、X4、X5、X7分别代表培养液初始pH值、接种量（%）、温度（℃）、培养时间（h）和装样量（mL/mL），并设X3、X6、X8三个空白作为误差分析项。每个因素取高低两个水平，高水平为低水平的1.5倍，每组试验设计3次重复来测定抑菌圈直径。PB试验设计及响应值及结果见表2。运用Design Expert 8.0.6软件对各个因素进行分析，选出显著因素进行进一步分析。

利用Design Expert 8.0.6软件对PB试验结果进行方差分析，结果见表3。由表3可知，对抑菌效果有显著影响的因素包括培养液初始pH值、温度、装样量，因此，选取这3个因素作为显著影响因素进行最陡爬坡试验。其中培养液初始pH值和装样量具有正效应，温度具有负效应。

表2 Plackett-Burman试验设计及结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman试验设计的因素水平及主效应分析Table 3 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design and main effects analysis

2.2 最陡爬坡试验

爬坡试验的目的在于选出最佳水解度范围作为响应面试验因素水平的中心点进行响应面试验设计[14]。根据表3各因素对酵母菌抑菌效果影响从大到小为：培养液初始pH值＞装样量＞培养温度。由于培养液初始pH值和装样量具有正效应，培养温度具有负效应，可以确定爬坡方向并选择合理步长（培养液初始pH值正向增加0.5，装样量正向增加5 mL，温度减少0.5℃），每个试验重复3次，取平均值。试验设计和结果如表4所示。由表4可知，抑菌圈最大响应值在第3组与第5组试验之间，因此，以第4组试验条件为后续试验中心点。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3 响应面分析法优化结果

经爬坡试验得出Box-Behnken试验的中心点，选择3因素3水平进行试验设计[15-16]，对培养液初始pH（A）、培养温度（B）、装样量（C）进行研究，以抑菌圈直径（Y）为响应值，分别以-1、0、1编码，响应面试验因素与水平见表5，Box-Behnken试验设计及结果见表6。

表5 响应面分析试验因素与水平Table 5 Factors and levels of response surface experiments

表6 Box-Behnken试验设计及结果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

运用Design Expert 8.0.6软件响应面分析程序对15组试验的响应值进行回归分析，经过回归方程拟合，得到各个试验因子的回归方程为：

回归方程的方差分析结果见表7。由表7可知，P＜0.01，失拟项P值＞F值＞0.05，说明回归模型显著极显著，失拟检验不显著（P＞0.05），即该模型在所研究区域内拟合性较好。回归方程的决定系数R2=0.952 1，表明实际试验与预测值具有高度相关性，该模型可信度高，可以对发酵产物的抑菌效果进行预测。一次项A影响达到极显著水平（P＜0.01），B、C影响不显著（P＞0.05）；交互项AB影响达到极显著水平（P＜0.01），AC、BC影响不显著（P＞0.05）；二次项A2、C2影响达到极显著水平（P＜0.01），B2影响显著（P＜0.05）。表明各因素对抗菌效果影响的影响不是简单的线性关系。

表7 回归方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

2.4 响应曲面分析

培养液初始pH与温度交互作用对抑菌圈直径影响的响应面及等高线图见图1。由图1可知，随着温度和培养液初始pH不断增大，抑菌圈直径先上升后下降，说明这两者过大或过小都不能使抑菌圈直径达到最大值，只有当它们取某个适中值时，抑菌圈直径才可达到最大值。通过软件进一步分析计算，预测最大抑菌圈直径为18.4 mm，此时培养液pH为9.44，培养温度为25℃，装样量为61.06 mL/150 mL。

图1 培养液初始pH值和培养温度交互作用对抑菌圈直径影响的响应面图和等高线图Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH value of culture medium and culture temperature on the inhibition zone diameter

2.5 验证试验

通过Design Expert8.0.6软件得到的最优发酵条件为培养液初始pH 9.44、培养温度25℃、装样量61.06 mL/150 mL。为验证模型的准确性和有效性，对预测的最佳发酵条件和初始发酵条件分别进行摇瓶发酵试验，平行试验3次，结果取平均值。为方便实际操作修改条件为培养液初始pH 9.4、培养温度25℃、装样量61 mL/150 mL、接种量8%、培养时间60 h。回归方程所得出的最高产量的预测值18.4 mm与验证试验的平均值17.9mm接近，抑菌圈直径比优化前（13.5mm）提高了32.6%。

3 结论

在试验室前期试验的基础上，以异常毕赤酵母（Pichia anomala）0732-1为试材试，利用响应面法优化异常毕赤酵母0732-1抑菌产物发酵条件，得到最佳发酵条件：培养液初始pH 9.4、培养温度25℃、装样量61 mL/150 mL、接种量8%、培养时间60 h。经响应面优化及验证试验得到最大抑菌圈直径17.9 mm，较优化前抑菌效果提高32.6%，为后续酵母菌的生产应用奠定了基础。

参考文献：

[1]WALKERGM.Pichiaanomala：cell physiology and biotechnology relativeto other yeasts[J].Anton Leeuw,2011,99(1)：121-125.

[2]BAHARO,BURDMAN S.Bacterial fruit blotch：a threat to thecucurbit industry[J].Israel J Plant Sci,2010,58(1)：19-31.

[3]SCHAAD N W,POSTNIKOVA E,SECHLER A,et al.Reclassification of subspecies of Acidovorax avenae as A.avenae(Manns 1905)emend,A.cattleyae(Pavarino,1911)comb.nov.,A.citrulli(Schaad et al.,1978)comb.nov.,and proposal of A.oryzae sp.nov.[J].Syst Appl Microbiol,2008,31(6)：434-446.

[4]阎莎莎，王铁霖，赵廷昌.瓜类细菌性果斑病研究进展[J].植物检疫，2011，25（3）：71-76.

[5]李国英，任毓忠，张 昕，等，甜瓜细菌性病害药剂防治试验[J].中国西瓜甜瓜，2003，16（4）：17-19.

[6]WANG X D,LI G Q,JIANG D H,et al.Screening of plant epiphytic yeasts for biocontrol of bacterial fruit blotch(Acidovorax avenae subsp.citrulli)of hamimelon[J].Biol Control,2009,50(2)：164-171.

[7]陈好娟.Pichiaanomala0732-1发酵培养基的优化及其抑菌成分的研究[D].石河子：石河子大学，2014.

[8]方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业科学出版社，1998：46-50.

[9]王晓东.防治哈密瓜细菌性果斑病拮抗酵母菌的筛选及其生防机理研究[D].武汉：华中农业大学，2009.

[10]黄文红，冯玉红，李嘉诚，等.Plackett-Burman设计和响应面法优化芥子中硫苷的超声波提取工艺[J].中国粮油学报，2016，31（7）：76-81.

[11]李志华.基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CN1021发酵培养基优化[J].中国酿造，2014，33（2）：23-27.

[12]熊志强，徐 平，涂国全，等.利用响应面法优化红谷霉素发酵培养基[J].微生物学通报，2006，33（4）：5-9.

[13]宋 萍，戚小灵，谢宁昌，等.响应面法优化枯草芽孢杆菌产脂肪酶的合成培养基[J].中国生物工程杂志，2010，30（8）：100-105.

[14]张 桢，杨贤庆，马海霞.Plackett-Burman法和中心组合法优化罗非鱼下脚料酶解工艺[J].食品科学，2011，32（18）：1-5.

[15]陈昌勇，何腊平，李翠芹，等.Plackett-Burman设计和响应面法优化速冻紫苏籽肉丸的配方[J].食品工业科技，2016，37（4）：259-265.

[16]李志华.基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CN1021发酵培养基优化[J].中国酿造，2014，33（2）：23-27.