玉米六肽的酶法糖基化修饰对产物生物活性的影响

王晓杰，刘晓兰，丛万锁，郑喜群

（齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院 黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

玉米蛋白粉是湿法玉米淀粉加工中产量最大、蛋白质含量最高的副产物。玉米蛋白粉中约含62%～71%的蛋白质，其主要组分是玉米醇溶蛋白（65%～68%）和谷蛋白（22%～33%）[1]。玉米醇溶蛋白分子内存在大区域的α-螺旋结构，使之具有很强的疏水性，是高憎水蛋白，而谷蛋白（约为22%）也只溶于碱性水溶液中[2]。因此，玉米蛋白的食品功能性很差，国内大都作为饲料出售。

目前，食品蛋白质的改性主要是采用美拉德反应。美拉德反应能够显著改善蛋白质的溶解性、乳化性、泡沫性、凝胶性以及抗氧化活性[3-7]。然而，美拉德反应难以控制糖基化度，还会导致产生致突变物而存在安全隐患，所以需要研究一种更安全、更有效的方法来替代美拉德反应进行食品蛋白质的糖基化修饰。

转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）能催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺（供体）和不同化合物的ε-氨基（受体）之间异肽键的形成[8]。如果酰基受体由含有赖氨酸残基的蛋白质提供，则发生蛋白质分子内或分子间的交联反应；如果受体由含有伯胺基团的糖提供，则发生糖与蛋白质的共价结合反应，即发生蛋白质的酶法糖基化修饰。已有研究表明，TGase催化的蛋白质糖基化反应能够改善蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性、流变学性质等功能性质[9-11]，并且其反应条件比美拉德反应更温和，不存在美拉德反应中所存在的副反应。

玉米蛋白含有高比例的酰胺基氨基酸，且赖氨酸残基含量少，因此，在含有伯胺基团的糖的反应体系中，TGase催化的糖基化反应主要发生在玉米蛋白与供糖体之间，而发生在蛋白质之间的交联反应几率低，因此玉米蛋白是酶法糖基化修饰的良好底物。但是由于糖基化反应体系比较复杂，所以无法直接确认糖基化反应是否发生。

基于TGase的催化机理，本研究在前期研究工作中，从玉米蛋白水解物中分离出一个氨基酸序列为谷氨酰胺-谷氨酰胺-脯氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-色氨酸（Gln-Gln-Pro-Gln-Pro-Trp）的六肽，该六肽分子中含有三个谷氨酰胺残基，在含有D-氨基葡萄糖的反应体系中，TGase能将D-氨基葡萄糖共价连接在六肽分子上形成糖肽，由于该反应体系中干扰小，反应机制清楚，可以利用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）质谱确定D-氨基葡萄糖糖基化反应是否发生，为糖蛋白或糖肽制备的机理提供理论依据。同时对糖基化修饰产物的部分生物活性进行研究，以表征糖基化修饰对玉米六肽生物活性的影响，为玉米糖蛋白/肽在食品工业的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米六肽（纯度＞99%）：上海波泰生物科技有限公司合；微生物TGase（酶活力为1 000 U/g）：泰兴市一鸣生物制品有限公司；D-氨基葡萄糖、硫代巴比妥酸：上海生工生物有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2-azino-bis（3-ethyl benzo-thiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、2-脱氧-D-核糖：美国Sigma公司；氧化型辅酶Ⅰ：上海宝曼生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PC/PLCLD-53真空冷冻干燥机：美国Millrock公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；pB-10 pH计：北京赛多利斯仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；EnSpire多功能酶标仪：珀金埃尔默公司；Waters Xevo G2 QTof高分辨质谱仪：美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1 玉米六肽的糖基化修饰

向3%的玉米六肽溶液中添加D-氨基葡萄糖，保证反应体系中酰基供体与酰基受体的物质的量比为1∶3，用浓度为3 mol/L NaOH调节pH至7.0，按60 U/g蛋白的加酶量加入TGase，反应混合物充分混匀后，置于37℃恒温水浴振荡器中反应8 h。反应结束后，置于85℃水浴锅中灭酶5 min，冷却至室温后冷冻干燥即获得玉米糖肽。

1.3.2 玉米六肽糖基化修饰产物的反相高效液相色谱分析

测定方法参照文献[2]。色谱柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相A：正丁胺，磷酸，四氢呋喃水溶液；流动相B：流动相A与乙腈等体积混合的溶液；洗脱条件：0～30 min，96%A，4%B；30～45 min，100%B，洗柱；45～65 min，96%A，4%B，平衡20 min；紫外检测器，检测波长230 nm；进样量：20μL。

1.3.3 玉米六肽及其糖基化修饰产物的质谱分析

采用WatersXevo G2QTof MS系统，离子源为电喷雾离子化（electrospray ionization，ESI）源；离子源温度：300℃；毛细管电压：3.0kV；雾化器温度：300℃；雾化器流速：600L/h；采集模式：全信息串联质谱（MSE）。

1.3.4 玉米六肽及其糖基化修饰产物抗氧化活性的测定

测定指标包括四种自由基清除活性（DPPH、ABTS、羟基自由基和超氧阴离子自由基），还原力和亚铁离子螯合活性。测定方法均参照文献[12]，略有改动，即DPPH自由基和ABTS自由基清除实验采用多功能酶标仪测定。所有实验均以质量浓度为0.012 2 g/mL的D-氨基葡萄糖为对照（在17.5 mL的反应体系中含有D-氨基葡萄糖0.207 7 g）。

1.3.5 玉米六肽及其糖基化修饰产物体外促酒精代谢活性的测定

参考瓦勒-霍赫（Valle&Hoch）法[13]，略有改动。将待测物配制成质量浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液（以蛋白基计）。在测定管中分别加入pH为8.8的焦磷酸钠缓冲液1.5 mL，27 mmol/L氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）1.0mL，体积分数11.5%的乙醇溶液0.5mL，各浓度待测物0.1 mL，混合后，放入25℃的水浴中加盖温浴5 min。温浴后的测定管立即加入乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）（0.25 U/mL）0.1 mL，摇匀后立即用分光光度计测定其在波长340nm处的吸光度值，以后每隔10 s读数一次，连续测定5 min，取反应最初的线性部分作图，记斜率为K p。以0.5mL蒸馏水代替0.5mL体积分数为11.5%的乙醇溶液，作参比调零，以0.1 mL蒸馏水代替0.1 mL待测物，测定对照组波长340nm处的吸光度值，以后每隔10 s读数一次，连续测定5min，取反应最初的线性部分作图，记斜率为K c。ADH激活率的计算公式如下：

式中：K p为测定管的线性斜率；K c为对照管的线性斜率。

2 结果与分析

2.1 玉米六肽糖基化反应的确认

2.1.1 玉米六肽糖基化修饰产物的RT-HPLC分析

氨基葡萄糖标准溶液和糖基化修饰玉米六肽经酸水解后，利用邻氨基苯甲酸衍生试剂标记后进行HPLC检测分析，HPLC谱图如图1所示。

由图1可知，D-氨基葡萄糖标准溶液（图1 A）和玉米六肽糖修饰产物（图1 B）在保留时间为10 min、11 min的谱图特征相同，均出现了氨基葡萄糖（峰1）及其在酸性介质中衍生时产生的差向异构体（氨基甘露糖的衍生产物，峰2），这与JIANG SJ等[9-10]的研究结果一致。HPLC分析结果表明，在糖基化修饰产物中含有D-氨基葡萄糖分子。

图1 D-氨基葡萄糖标准品（A）和糖基化修饰玉米六肽（B）的RT-HPLC色谱图Fig.1 RT-HPLC chromatogram of D-glucosamine standard(A)and glycosylated corn hexapeptide(B)

2.1.2 玉米六肽及其糖基化修饰产物的质谱分析

将玉米六肽和经D-氨基葡萄糖糖基化修饰生成的糖肽进行ESI-质谱分析，通过分子质量迁移进一步表征D-氨基葡萄糖是否成功连接到玉米六肽分子上，实验结果如图2所示。

图2 玉米六肽（A）及玉米糖肽（B）的ESI-MS图Fig.2 ESI-MS spectrum of corn hexapeptide(A)and corn glycopeptide(B)

由图2A可知，玉米六肽的分子质量为783.38，实际上玉米六肽的分子量为782，因此，玉米六肽在ESI质谱中属于M+H型分子。在TGase的催化下，如果将一分子D-氨基葡萄糖（分子质量为179）共价连接到玉米六肽分子上，将释放出一分子NH3，使分子量迁移162[15]，即连接一个D-氨基葡萄糖的糖肽的分子质量为944。由图2B可知，有分子质量为944的组成存在，说明有一分子的D-氨基葡萄糖共价连接到玉米六肽分子上，确认酶法糖基化反应发生。

2.2 糖基化修饰对玉米六肽抗氧化活性的影响

2.2.1 糖基化修饰对玉米六肽DPPH自由基清除能力的影响

将玉米六肽和糖基化修饰产物分别配制成质量浓度为0.50mg/mL、0.65mg/mL、0.75mg/mL、0.85mg/mL、0.95mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖为对照，测定三者对DPPH自由基的清除活性，实验结果如图3所示。

图3 糖基化修饰玉米六肽对DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of the glycosylation on DPPH free radical scavenging rate of corn hexapeptide

由图3可知，随着样品质量浓度的增加，玉米六肽和糖基化修饰产物的DPPH自由基清除率均逐渐增大，并且均大于反应体系中D-氨基葡萄糖的清除能力。玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽清除DPPH自由基的半最大抑制浓度（50%effective concentration，EC50）值分别为1.28 mg/mL和1.04 mg/mL，说明糖基化修饰改善了玉米六肽对DPPH自由基的清除能力，可能是由于与玉米六肽共价结合的D-氨基葡萄糖能够向DPPH自由基提供氢原子，使DPPH自由基形成稳定的DPPH-H而致。

2.2.2 糖基化修饰对玉米六肽ABTS自由基清除能力的影响

将玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽分别配制成质量浓度为0.5 mg/mL、0.65 mg/mL、0.75 mg/mL、0.85 mg/mL、0.95 mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖为对照，测定三者对ABTS自由基的清除活性[16]，实验结果如图4所示。

由图4可知，玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽均具有ABTS自由基的清除能力，且清除能力与质量浓度之间呈正相关。玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽的EC50值分别为0.895mg/mL和0.799mg/mL，且两者的ABTS自由基清除率均大于D-氨基葡萄糖本身。可能是由于D-氨基葡萄糖共价连接到玉米六肽分子上，D-氨基葡萄糖分子上的羟基与ABTS自由基阳离子发生反应使溶液的吸光度值降低，糖肽清除ABTS自由基的能力增强。

图4 糖基化修饰玉米六肽对ABTS自由基清除率的影响Fig.4 Effect of the glycosylation on ABTS free radical scavenging rate of corn hexapeptide

2.2.3 糖基化修饰对玉米六肽羟基自由基清除率的影响

将玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽分别配制成质量浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖为对照，测定三者对羟基自由基的清除活性，实验结果如图5所示。

图5 糖基化修饰玉米六肽对羟基自由基清除率的影响Fig.5 Effect of the glycosylation on hydroxyl free radical scavenging rate of corn hexapeptide

由图5可知，玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽对羟基自由基的清除能力都随着样品质量浓度的增加而逐渐增大。在质量浓度为2.5 mg/mL时，玉米糖肽的羟基自由基清除率为23.98%，比玉米六肽高63.13%。糖肽清除羟基自由基的能力增强，分析有两方面原因：（1）作为氢原子供体，与羟基自由基反应抽提氢，阻止了自由基的链式反应；（2）作为金属螯合剂，能够与Fe2+螯合而抑制羟基自由基的产生。

另外，玉米糖肽的羟基自由基清除率低于反应体系中D-氨基葡萄糖的清除率，分析可能的原因是氨基葡萄糖发挥清除羟基自由基活性时，依靠其分子上含有活泼氢的羟基和活泼的氨基[17]，在糖基化反应过程中，氨基葡萄糖与玉米六肽共价结合，封闭了两者分子中一些具有抗氧化功能的基团，如活泼氨基等，从而使清除率下降。

2.2.4 糖基化修饰对玉米六肽超氧阴离子自由基清除活性的影响

超氧阴离子是需氧细胞线粒体内电子转移产生的一种自由基，它在机体内会长时间攻击靶细胞，具有较强的氧化毒性，从而引起机体的病变与衰老[18]。采用邻苯三酚自氧化法测定玉米六肽、D-氨基葡萄糖和玉米糖肽对超氧阴离子自由基的清除能力，实验结果如图6所示。

图6 糖基化修饰玉米六肽对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.6 Effect of the glycosylation on superoxide anion radical scavenging rate of corn hexapeptide

由图6可知，玉米六肽和玉米糖肽对超氧阴离子自由基的清除能力均与浓度呈正相关。在质量浓度为2.5mg/mL时，玉米糖肽对超氧阴离子自由基的清除率为18.30%，比玉米六肽高16.29%。同时，在质量浓度＞1.0 mg/mL时，玉米六肽和玉米糖肽对超氧阴离子自由基的清除率都高于反应体系中D-氨基葡萄糖的清除率，说明糖基化修饰改善了玉米六肽的抗氧化活性，原因是D-氨基葡萄糖提供的酰基受体共价连接到玉米六肽的谷氨酰胺残基上，玉米六肽分子中具有的抗氧化活性的氨基酸，如N-末端的Trp与D-氨基葡萄糖分子中存在还原端基和伯、仲-OH的协同作用，改善了玉米六肽原有的超氧阴离子自由基清除能力。

2.2.5 糖基化修饰对玉米六肽还原力的影响

将玉米六肽和玉米糖肽分别配制成质量浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖为对照，测定三者的还原力，实验结果如图7所示。

由图7可知，玉米糖肽和玉米六肽的还原力都随着质量浓度的增加呈逐渐增加的变化趋势。与玉米六肽相比，玉米糖肽的还原力明显增大，在2.5 mg/mL时，玉米糖肽的还原力为1.988，比玉米六肽高143.37%，说明在TGase的催化作用下，玉米六肽成为良好的电子供体，通过提供电子给Fe3+，将其还原成Fe2+形式，使普鲁士蓝的生成量增加，波长700 nm处的吸光度值升高，使样品的还原力增强。

图7 糖基化修饰玉米六肽对还原力的影响Fig.7 Effect of the glycosylation on reducing power of corn hexapeptide

2.2.6 糖基化修饰对玉米六肽亚铁离子螯合能力的影响

金属离子在自由基氧化过程中起催化剂作用，将金属离子螯合可以钝化金属离子的催化作用，大大降低自由基的氧化作用。将玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽分别配制成质量浓度为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖为对照，测定三者对亚铁离子的螯合能力，实验结果如图8所示。

图8 糖基化修饰玉米六肽对亚铁离子螯合能力的影响Fig.8 Effect of the glycosylation on Fe2+-chelating capacity of corn hexapeptide

由图8可知，玉米六肽和D-氨基葡萄糖都不具有亚铁离子螯合能力，而糖基化修饰产物具有亚铁离子的螯合能力，并且随着样品浓度的增加螯合能力逐渐增大。在质量浓度为2.5 mg/mL时，亚铁离子螯合率达到13.33%，与玉米六肽相比提高100%。说明糖基化修饰玉米六肽可以通过与亚铁离子螯合来阻止自由基链式反应，从而消除自由基的氧化对机体造成伤害，与2.2.3部分的实验结果相一致。

2.3 糖基化修饰对玉米六肽体外促酒精代谢活性的影响

将玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽分别配制成质量浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖为对照，测定三者体外的乙醇脱氢酶激活率，以表征样品的体外促酒精代谢活性，实验结果如图9所示。

图9 糖基化修饰玉米六肽对ADH激活率的影响Fig.9 Effect of the glycosylation on ADH activation rate of corn hexapeptide

由图9可知，D-氨基葡萄糖本身对ADH的激活率仅为0.65%，而玉米六肽和糖基化修饰玉米六肽的ADH激活率均随着质量浓度的升高而逐渐增加。在质量浓度为2.5mg/mL时，糖基化修饰玉米肽的ADH激活率为12.11%，比玉米六肽的ADH激活率高9.95%，说明糖基化修饰玉米六肽具有更好的体外促酒精代谢活性，可能的原因是D-氨基葡萄糖和玉米六肽共价结合的产物更有利于稳定NAD+，而NAD+是ADH的辅酶，进而使得玉米糖肽的ADH激活率增强。ADH是参与乙醇在体内代谢的主要酶，玉米糖肽能够通过激活ADH来降低乙醇的浓度而达到促酒精代谢的目的，对预防酒精性肝损伤、酒精中毒等具有重要的意义。

3 结论

为了研究酶法糖基化反应的机制，本实验以微生物TGase作为催化剂，D-氨基葡萄糖为酰基受体，通过糖基化反应修饰玉米六肽（Gln-Gln-Pro-Gln-Pro-Trp）制备玉米糖肽。ESI-质谱结果表明，在TGase的催化下，D-氨基葡萄糖与玉米六肽发生共价连接，酶法糖基化反应发生。与玉米六肽相比，玉米糖肽具有更高抗氧化活性和体外促酒精代谢等生物活性。这些实验结果为糖基化玉米肽在食品工业的应用提供参考。

参考文献：

[1]GIOIA L D,CUQ B,GUILBERT U S.Effect of hydrophilic plasticizers on thermomechanical properties of corn gluten meal[J].Cereal Chem,1998,75(4)：514-519.

[2]WANG X J,ZHENG X Q,LIU X L,et al.Preparation of glycosylated zein and retarding effect on lipid oxidation of ground pork[J].Food Chem,2017,227(7)：335-341.

[3]NASROLLAHZADEHF,VARIDIM,KOOCHEKIA,et al.Effect of microwave and conventional heating on structural,functional and antioxidant propertiesof bovineserum albumin-maltodextrin conjugatesthrough Maillard reaction[J].Food Res Int,2017,100(10)：289-297.

[4]YU M,HE S D,TANG M M,et al.Antioxidant activity and sensory characteristics of Maillard reaction products derived from different peptidefractionsof soybean meal hydrolysate[J].Food Chem,2018,243(3)：249-257.

[5]LI Y,ZHONG F,JIW,et al.Functional properties of Maillard reaction products of riceprotein hydrolysates with mono-,oligo-and polysaccharides[J].Food Hydrocolloid,2013,30(1)：53-60.

[6]XUEF,LIC,ZHU X,et al.Comparative studies on the physicochemical propertiesof soy protein isolate-maltodextrin and soy protein isolate-gum acacia conjugate prepared through Maillard reaction[J].Food Res Int,2013,51(2)：490-495.

[7]SU GW,ZHENGL,CUIC,et al.Characterization of antioxidant activity and volatile compounds of Maillard reaction products derived from different peptidefractionsof peanut hydrolysate[J].Food Res Int,2011,44(10)：3250-3258.

[8]KIELISZEK M,MISIEWICZ A.Microbial transglutaminase and its application in thefood industry：A review[J].Folia Microbiol,2014,59(3)：241-250.

[9]JIANG SJ,ZHAO X H.Cross-linking and glucosamine conjugation of casein by transglutaminase and the emulsifying property and digestibility in vitro of the modified product[J].Int J Food Prop,2012,15(6)：1286-1299.

[10]SONG C L,ZHAO X H.The preparation of an oligochitosan-glycosylated and cross-linked caseinate obtained by a microbial transglutaminaseand itsfunctional properties[J].Int J Dairy Technol,2014,67(1)：110-116.

[11]SONG C L,ZHAO X H.Structure and property modification of an oligochitosan-glycosylated and crosslinked soybean protein generated by microbial transglutaminase[J].Food Chem,2014,163(11)：114-119.

[12]WANGX J,ZHENGX Q,KOPPARAPU N K,et al.Purification and evaluation of a novel antioxidant peptide from corn protein hydrolysate[J].Process Biochem,2014,49(9),1562-1569.

[13]VALLEE B L,HOCH F L.Zinc：A component of yeast alcohol dehydrogenase[J].P Natl Acad Sci USA,1955,41(6)：327-328.

[14]HONG PK,GOTTARDID,NDAGIJIMANA M,et al.Glycation and transglutaminase mediated glycosylation of fish gelatin peptides with glucosamineenhancebioactivity[J].Food Chem,2014,142：285-293.

[15]曾维才，石 碧.天然产物抗氧化活性的常见评价方法[J].化工进展，2013，32（6）：1205-1212.

[16]孙 涛，巢 骏，熊小英，等.C60-D-氨基葡萄糖衍生物的制备及其抗氧化性的研究[J].上海海洋大学学报，2010，19（3）：404-409.

[17]SUN T,XIE W M,XU P X.Superoxide anion scavenging activity of graft chitosan derivatives[J].Carbohyd Polym,2004,58(4)：379-382.