广东客家黄酒中乳酸菌分离鉴定与菌株特性研究

钱 敏，汤斯斯，赵文红*，莫依灿，苏晓莉，李 斌

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642）

广东客家黄酒是黄酒的一个重要分支，已有两千多年的历史，黄酒中细菌的种类众多，有研究者利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorptiontimeof flight massspectrometry，MALDI-TOF）与指纹识别结合16SrRNA基因测序和种特异的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术鉴定出黄酒发酵中的细菌有芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、明串珠菌属（Ascococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳酸菌等[1]。其中，乳酸菌在黄酒发酵过程中起到了很大作用，与酵母共同发酵，对酒的口感与香气起着决定性作用[2]，其来源主要是酒曲和黄酒在初发酵时从空气接入[3-5]。在以往的广东客家黄酒的微生物研究中，鲜有对乳酸菌的分离与鉴定，而乳酸菌与黄酒的发酵与品质有着重要的联系，因此将乳酸菌分离鉴定，进行单独研究有重要的意义。

近年来乳酸菌对外界的特性逐渐成为人们研究的热点，乳酸菌的耐药能力、耐乙醇能力等特性在医学与食品领域被广泛利用[6]。通过研究其特性，可以筛选出适用于酿造的菌种，对酒类发酵的影响研究也起到重要的铺垫作用[7-9]。本研究结合黄酒的发酵条件，对黄酒酒曲与发酵酒醪中乳酸菌菌株进行分离纯化，对其进行形态学、生理生化、分子生物学鉴定，并对其生长曲线，产酸能力，对盐、pH、糖及乙醇的耐受性进行测定，以期为探究乳酸菌对黄酒发酵的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米：散装市售；米酒（酒精度为29.5%vol）：广东省九江双蒸酒；红曲、麦曲、酒药：广东河源紫金某酒厂；071880乳杆菌生化鉴定盒、溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）培养基、MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

GI54DW型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；B104光学生物显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；电磁pHS-3CpH计：上海精密科学仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：宁波江南仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离

酒曲中乳酸菌分离：分别将1 g酒曲样品（红曲、麦曲、酒药）磨成粉，溶于无菌生理盐水中，进行梯度稀释。吸取0.2 mL稀释液涂布于BCP琼脂平板培养基，放入装有厌氧产气剂的产气袋中，将产气袋置于35℃的恒温培养箱中，培养48 h后，挑取单菌落进行划线分离，反复对每次培养完成后的菌落进行简单染色并镜检，判断其纯度。分离出纯的菌株后，划线于MRS斜面培养基上，置于35℃培养箱扩大培养48 h，进行生理生化鉴定实验，将初步确定为乳酸菌的菌株划线接种于MRS斜面培养基上，35℃培养48 h，保存于4℃冰箱中[10-11]。

酒醪中乳酸菌分离：取5 g酒醪置于无菌生理盐水中搅拌得到样品液，以酒曲中乳酸菌分离方法进行纯化[12-14]。

1.3.2 乳酸菌的鉴定

采用菌落形态观察、生理生化特性试验以及分子生物学鉴定方法相结合[15-16]：对菌株进行革兰氏染色，观察其形态；接入微型生化鉴定管进行菌属鉴定[17]；利用Ezup柱式细菌基因组抽提试剂盒进行基因组的提取，提取后的DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司进行DNA测序，通过菌株序列16SrDNA序列对比分析及利用Mega6.0制作系统发育树[18]。

1.3.3 乳酸菌的菌株特性

（1）生长曲线的测定

将2 McFarland浓度菌悬液按照2%（V/V）的接种比例，将菌悬液接入到24支装有MRS液体培养基中的试管中，35℃条件下静置培养，每隔2 h取出一支测菌液OD600nm值。以无菌MRS肉汤培养基作为空白实验组，在波长600 nm条件下进行OD600nm值测定，让菌液的测定结果值在0.10～0.65的范围内，若结果值是稀释后所得，则必须要乘以稀释倍数才是菌液的实际OD600nm值。

（2）产酸能力测定

将2 McFarland的菌悬液，按1%（V/V）接种于MRS肉汤培养基中，35℃厌氧条件下培养48 h。每隔6 h测定培养基pH[19-20]。

（3）pH对乳酸菌生长特性的影响

用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH调节MRS液体培养基，使其pH分别为2、4、6、8、10、12。将2 McFarland的菌悬液，按1%（V/V）接种于上述培养基中，35℃厌氧条件下培养15～20 h后，取上述处理菌液，于波长600 nm处测定OD600nm值[21-23]，考察pH对乳酸菌生长特性的影响。

（4）糖含量对乳酸菌生长特性的影响

参照文献[24]中黄酒酿造过程中的总糖实验数据，用葡萄糖将MRS肉汤培养基的糖含量调节为30～240 g/L，以30 g/L为梯度制成8个浓度液体培养基，将2 McFarland的菌悬液，按1%（V/V）接种于上述培养基中，35℃厌氧条件下培养15～20 h后，取上述处理菌液，于波长600 nm处测定OD600nm值[25]，考察糖含量对乳酸菌生长特性的影响。

（5）乙醇含量对乳酸菌生长特性的影响

参照文献中黄酒酿造过程中酒精度的变化数据[26]，将MRS肉汤培养基的酒精度调节为6%vol～30%vol，以6%为梯度制成5个浓度液体培养基，按1%（V/V）的接种量接种于上述培养基中，35℃厌氧条件下培养15～20h后，取上述处理菌液，分光光度计在波长600 nm处测定OD600nm值[27]，考察乙醇含量对乳酸菌生长特性的影响。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定

2.1.1 乳酸菌的分离与纯化

经过分离与纯化，得到两株乳酸菌A、E，菌株在BCP琼脂培养基上生长的菌落形态如图1所示，MRS琼脂培养基的菌落形态如图2所示，镜检结果如图3所示。

由图1可知，在BCP琼脂培养基上，菌株A与E均可生长，且都可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，其中菌株E更容易使溴甲酚紫变色，可初步判定两株菌为乳酸菌。两者单个菌落微小，皆＜0.5 mm，呈圆形，单个菌落呈现淡黄色，湿润，中央凸起，边缘整齐，表面光滑有光泽，而菌株A菌落比E菌落稍大。

由图2可知，在MRS琼脂培养基上，菌株A与E长势很好，两者单个菌落较在BCP培养基上生长要大，这与MRS培养基里的充足营养有关系，菌落大小在0.5～3.0mm之间，为圆形，单个菌落呈现乳白色，湿润，中间有凸起，边缘整齐，表面光滑有光泽，且菌株A菌落比E菌落大。

图1 菌株A和E在BCP琼脂培养基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of strain A and E on BCP agar medium

图2 菌株A和E在MRS琼脂培养基上的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of strain A and E on MRS agar medium

图3 菌株A和E的革兰氏染色结果Fig.3 Results of strain A and E by Gram stain

由图3可知，菌株A与E皆为革兰氏阳性菌，个体微小，杆状直线型菌，无鞭毛，无芽孢。菌株A多以两个菌体排列，菌株E则多为单个菌体存在，菌株A个体明显比菌株E大。

2.1.2 乳酸菌的生化鉴定

生化鉴定反应结果如表1所示。由表1可知，菌株A8种生化反应结果均为阳性，菌株E仅山梨醇反应为阴性，参考乳杆菌生化鉴定盒使用说明可判断菌株A与E为乳酸杆菌属（Lactobacillus）。

表1 菌株A和E的生理生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain A and E

2.1.3 乳酸菌的16SrDNA序列对比分析结果

将序列利用NCBI中的BLAST方法与GenBank中数据库中的序列比较，比较得到相似性为99%～100%的16SrDNA序列，从中随机选取100%的序列利用MEGA 6.0中的邻接法（Neighbour-Joining，NJ）构建系统发育树，重复1 000次，树为无树根[28]。系统发育树见图4。

菌株A命名为Hakka yellow rice wine A，由图4a可知，菌株A与植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）的相似率为100%，因此可以判断菌株A为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图4 菌株A(a)和菌株E(b)系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain A(a)and strain E(b)

菌株E命名为Hakkayellow ricewine E，由图4b可知，菌株E与戊糖乳杆菌（Lactobacilluspentosus）的相似率为100%，因此可以判断菌株E为戊糖乳杆菌（Lactobacilluspentosus）。

2.2 乳酸菌的菌株特性

2.2.1 生长曲线测定

经检测，菌株A与E生长48 h后的菌株生长曲线如图5所示。

图5 菌株A和E的生长曲线Fig.5 Growth curves of strain A and E

由图5可知，发现两者的生长情况几乎相同，但菌株E的生长比菌株A略微缓慢。2～6h时，菌株A和E生长缓慢，该时段为延缓期；在6～16 h，OD600nm值快速上升，可知此时菌株在快速生长繁殖，该时段为对数期；16～20 h时的OD600nm值上升缓慢，在20 h后几乎无变化，进入稳定期[29-30]。

2.2.2 产酸能力检测结果

菌株A和E在48 h内的产酸能力如图6所示。

图6 菌株A和E的产酸能力与培养时间的关系Fig.6 Relationship between acid-producing ability and culture time of strain A and E

由图6可知，菌株A与E的产酸能力相当，两种菌的pH在0～6 h时几乎无变化，在6～12 h时开始极速下降，该时段菌株处于对数期，菌株快速繁殖，故开始大量代谢酸性物质；12～24 h时酸度呈缓慢下降趋势，在24 h后酸度基本保持稳定，菌株A的pH为3.8左右，菌株E pH保持在3.6左右，这与菌株处于稳定期有一定关系。

2.2.3 pH对乳酸菌生长特性的影响

不同pH对菌株的生长情况如图7所示。

图7 不同p H对菌株A和E生长的影响Fig.7 Effects of different pH on the growth of strain A and E

由图7可知，两菌株在不同酸度的影响下，其生长趋势几乎相同，都是先随着pH的增加而稳步上升，达到1.9左右后保持平稳，当pH超过某个碱性值后，菌株的生长受到抑制而呈现下降趋势。其中，在pH为2～6区间里，菌株A与菌株E的生长随着酸度的减弱而不断增强，当pH6～8时的A菌OD600nm值最高，为1.969，当pH超过8后，其OD600nm值为0.475，说明当pH＞8，会严重阻碍菌株A的生长；菌株E在pH6～10时，OD600nm值1.9左右，在pH10～12时，OD600nm值接近为1左右，说明菌株E在pH＞10后，生长受到抑制。结果表明，菌株A和E的最适生长pH为4～6。

2.2.4 糖含量对乳酸菌生长特性的影响

不同糖含量对菌株A和E的耐受力影响结果见图8。

图8 不同糖含量对菌株A和E生长的影响Fig.8 Effects of different sugar concentrations on the growth of strain A and E

由图8可知，A菌和E菌的OD600nm值随着糖含量的增加呈现下降的趋势，尤其当糖含量＞90 g/L之后，菌株A和E OD600nm值迅速下降。因此，当糖含量＞90 g/L，菌株A和E的生长会受到一定的抑制。

2.2.5 乙醇含量对乳酸菌生长特性的影响

不同乙醇含量对菌株A和E的的影响，结果见图9。

图9 不同乙醇含量对菌株A和E生长的影响Fig.9 Effects of different ethanol contents on the growth of strain A and E

由图9可知，在乙醇含量为6%时，菌株E的OD600nm值为0.430，明显高于菌株A；随着乙醇含量的增加，菌株E的OD600nm值下降，当乙醇含量为30%时，OD600nm值为0.352；菌株A的起始OD600nm值为0.328，在乙醇含量为6%～18%，其OD600nm值下降速率较菌株E大，在乙醇含量18%～30%时，保持平稳在0.182左右，表明乙醇含量为18%时，对菌株A的抑制作用已达极限。因此，菌株A和E在乙醇含量＞6%之后，便受到抑制，并且菌株A较菌株E更为敏感。

3 结论

本研究对广东客家黄酒酒曲与发酵酒醪中的乳酸菌进行分离纯化得到菌株A和E，对这两株菌进行形态学、生理生化、分子生物学鉴定，确定这两株菌分别为植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）。本研究还对它们的生长曲线，产酸能力，对盐、pH、糖及乙醇含量的耐受性进行测定。两菌株生长曲线测定结果说明，在35℃条件下，培养2～6 h为菌株生长的延缓期，6～16 h为对数期，20 h后完全进入稳定期。产酸实验说明两菌株的产酸能力都很强；菌株A和E的最适生长pH值为4～6；当糖含量＞90 g/L，两菌株的生长受到抑制；菌株A和E在乙醇含量＞6%之后便受到抑制，并且菌株A较菌株E菌更为敏感。

乳酸菌是对黄酒发酵过程起重要作用的微生物，它的存在有利于黄酒风味的形成与发酵环境的稳定。目前对客家黄酒中乳酸菌的研究尚浅，特别是乳酸菌的种属确定、自身的代谢等都有待进一步探索，以期为黄酒品质的改善提供更多的理论依据。

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