糯高粱黄酒糖化工艺优化及抗氧化活性分析

郭 睿，杨 玲*，郭旭凯，段 冰，邵 强，柳青山，王花云

（山西省农业科学院 高粱研究所，山西 晋中 030600）

黄酒又称米酒，是我国的民族特产。黄酒酒精度低，耗粮少，集美味、营养和保健于一体。它富含多种氨基酸、蛋白质、维生素和对人体有益的矿物元素，并具有烹饪、药用等功效[1]，符合世界低度饮料酒发展的趋势，因而被国家列为重点扶植和发展的饮料酒之一[2]。优质原料是酿造高品质酒的基本条件。黄酒以稻米、黍米、玉米、小米等为主要原料[3]，南方黄酒主要选用糯米为原料，北方黄酒主要以黍米为原料，以高粱为主要原料酿造黄酒近年来鲜有报道。

酿造专用高粱中单宁含量达到1.0%～1.5%，发酵过程中单宁能被转化为分子质量小的多酚类物质。以高粱为原料经过酶、曲等发酵过程，原料和辅料中的黄酮和多酚类物质很容易溶于发酵液中[4]，且在发酵过程中，各种物质发生复杂的化学与生化反应，生成种类更多的酚类[5]。研究表明，黄酒酚类物质的含量与黄酒的抗氧化能力呈正相关关系[6]，多酚含量越多，黄酒的抗氧化活性越强。高粱籽粒中含有一定量的黄酮类化合物[7]，黄酮类物质具有清除体内自由基、抑制肿瘤、调节细胞周期、调节免疫力、抗菌、消炎多种生理功能[8]。多酚类物质具有抗病毒、抑菌、抗癌、抗辐射、抗动脉硬化、预防心脑血管疾病和中风等多种生理功能[9]，且有延长产品保质期的作用，在食品、医药以及保健品等方面具有广泛的应用价值[10]。

支链淀粉含量高的糯高粱易于糊化[11]，非常适合于酿酒有益微生物的生长繁殖和香味物质代谢。另外，在加工黄酒的过程中，糯性高粱吸水率较快、饱和吸水量较低，糊化温度低，具有省水节能的优势；且糯高粱价格要低于黍米、糯米等常用的黄酒酿造原料，采用糯高粱为原料酿制黄酒能够大幅降低原料成本，增加企业利润。因此，本研究提出以糯高粱为原料，酿酒大曲为糖化剂进行糖化发酵，在参考近年学者[12-14]采用响应面法优化工艺过程的基础上，利用Box-Behnken响应面法[15]对糯高粱糖化工艺进行优化，得到最佳工艺条件，使酿出的糯高粱黄酒富含大量氨基酸、糖和风味物质，使酒体更加有营养，创制一种新型的保健酒，并为其工业化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

晋糯3号糯高粱：产于山西省农科院高粱研究所试验田；大曲：购自山西汾阳某制曲厂（以大麦、豌豆为原料，大麦∶豌豆=6∶4）；黍米、藜麦：市售。

福林酚：北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（纯度＞97%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；乙醇、乙酸钾、三氯化铝、碳酸钠、盐酸、酒石酸钾钠、硫酸铜、氢氧化钠等均为市售分析纯；没食子酸（分析纯）、芦丁（纯度为95%）：美国西格玛-奥德里奇公司；分析试验用水为18.2MΩ超纯水，酿造用水为市政自来水。

1.2 仪器与设备

EBC-LF麦芽标准粉碎机：麦科仪科技有限公司；AL204电子天平：瑞士梅特勒-托利多集团；UV-3300紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖化工艺

首先将糯高粱清洗，去除杂质与浮土，晾干后用粉碎机粉碎，过18目筛备用。称取200 g筛上物加入120 mL沸水搅拌均匀加盖润粮12h。蒸锅水开后将糯高粱上锅蒸120min，期间晒水搅拌一次，保证将糯高粱蒸熟蒸透，摊凉后拌曲加水进行糖化，糖化结束后，测定糖化液中还原糖含量。

1.3.2 单因素试验

选择糖化过程的关键控制因素——加曲量、糖化时间、糖化温度3个单因素，通过单因素试验探讨其对糯高粱糖化过程中还原糖含量的影响。

（1）加曲量的影响

准确称取200g粉碎好的糯高粱，加沸水120 mL于室温润粮12 h后上蒸锅蒸熟，摊凉至室温后置于1 L烧杯中，拌入质量为糯高粱干质量5%、10%、15%、20%、25%的大曲，并加入煮沸杀菌的凉白开水使粮水比为1∶2（g∶mL），于55 ℃糖化24 h。

（2）糖化时间的影响

准确称取200 g粉碎好的糯高粱，加沸水120 mL于室温润粮12 h后上蒸锅蒸熟，摊凉至室温后置于1 L烧杯中，称质量，拌入质量为糯高粱干质量15%的大曲，并加入煮沸杀菌的凉白开水使粮水比为1∶2（g∶mL），于55 ℃分别糖化3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h。

（3）糖化温度的影响

准确称取200g粉碎好的糯高粱，加沸水120mL于室温润粮12 h后上蒸锅蒸熟，摊凉至室温后置于1 L烧杯中，称质量，拌入质量为糯高粱干质量15%的大曲，并加入煮沸杀菌的凉白开水使粮水比为1∶2（g∶mL），分别于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃糖化24 h。

1.3.3 响应面优化试验

根据单因素试验结果，采用响应面分析法优化糖化工艺参数，得出最佳糖化条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 糖化工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for saccharification process optimization

1.3.4 分析测试

（1）还原糖含量测定

将糖化液搅匀后取醪液5 mL置于10 mL离心管于4 000 r/min离心10 min，取上清液经0.45μm滤膜过滤得澄清醪液。醪液还原糖含量的测定采用斐林试剂法[16]。

（2）总多酚含量的测定

采用福林酚法[17]测定黄酒中的总多酚含量，根据实际情况略有改动。将样品稀释20倍，吸取200μL置于5mL容量瓶中，加入1 mol/L福林酚试剂0.75 mL混匀，加入质量分数20%的Na2CO3溶液1mL混匀，蒸馏水定容至5mL。30℃避光水浴90min，冷却至室温后于波长765nm处测定吸光度值。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，总酚含量以没食子酸计。

（3）总黄酮含量的测定

总黄酮含量的测定采用乙酸钾/氯化铝[18]法，根据实际情况略有改动。准确吸取200μL样品置于5 mL容量瓶中，加入0.75 mL三氯化铝（0.1 mol/L）和1 mL乙酸钾溶液（1 mol/L），蒸馏水定容至5 mL，充分摇匀后室温避光反应30 min，4 000 r/min离心10 min。取上清液于波长420 nm处检测其吸光度值。以芦丁为标准品绘制标准曲线，总黄酮含量以芦丁计。

（4）体外抗氧化活性试验

抗氧化活性分析选用DPPH法[19]。准确称取10mg DPPH，用体积分数为95%的乙醇溶液超声辅助溶解，定容至100 mL，置于-20℃冰箱中保存，随用随取。精密吸取20 mL母液，用体积分数为95%乙醇定容至100 mL，此工作液的浓度即为50μmol/L[20-21]。精密吸取20μL、40μL、60μL、80μL、100μL黄酒液，蒸馏水补齐至200μL，加入3 mL工作液，避光室温反应90 min，4 000 r/min离心10 min后于波长517 nm处比色[22]，测定的吸光度值记作As。以体积分数为95%乙醇代替DPPH工作液，所测得吸光度值记作Ar。吸取200μL蒸馏水，加入3 mL工作液，避光室温反应90 min，于波长510 nm处比色，测定的吸光度值记作A0，DPPH自由基清除率按下式计算：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 加曲量对糯高粱黄酒糖化过程还原糖含量的影响

本试验糖化剂为大曲，不同加曲量对还原糖含量的影响结果见图1。由图1可知，随着加曲量的增加，糯高粱黄酒糖化过程的还原糖含量先急剧增加，后趋于平缓，当加曲量为15%时，糖化液的还原糖含量达到最大值，继续提高加曲量还原糖的含量没有显著升高。因此，最佳加曲量为糯高粱干质量的15%。

图1 加曲量对还原糖含量的影响Fig.1 Effect of Daqu inoculum on reducing sugar contents

2.1.2 糖化时间对糯高粱糖化过程还原糖含量的影响

图2 糖化时间对还原糖含量的影响Fig.2 Effect of saccharification time on reducing sugar contents

糖化时间对还原糖含量的影响结果见图2。由图2可知，在糖化过程中，随着时间的推移，大曲中的各种酶类被激活，糊化醪中的淀粉、蛋白质、半纤维素等不溶性高分子物质被大曲中的复合酶系水解成糖类、糊精、氨基酸等可溶性的低分子物质，糖度逐渐增加，当达到24 h后，糊化醪中的还原糖含量随着糖化时间的延长不再显著增加，出于经济的角度，糖化时间30 h为宜。

2.1.3 糖化温度对糯高粱糖化过程还原糖含量的影响

糖化温度对还原糖含量的影响结果见图3。由图3可知，随着糖化温度的升高，糯高粱黄酒酿制过程中还原糖含量呈先增加后减少的趋势，在糖化温度为55℃时还原糖含量最大。这是因为糖化温度较低时，不能充分激活糖化酶的活力，影响熟化淀粉的糖化效果；糖化温度偏高使得各种淀粉酶失活，淀粉不能被糖化[23]。因此，最佳糖化温度为55℃。

图3 糖化温度对还原糖含量的影响Fig.3 Effect of saccharification temperature on reducing sugar contents

2.2 响应面试验数据处理及模型拟合

采用Design Export 10.0.3软件对前期响应面试验设计所做得的糯高粱糖化数据进行处理，试验结果见表2，表2中1、7、8、11、17号试验为中心零点试验，重复5次，以估计试验误差，其他试验为析因试验。根据试验相应值进行因变量与自变量的多元线性回归和二项式方程拟合，得到还原糖含量Y预测值对自变量的二次多项式回归方程：Y=17.08+0.27A+0.44B+0.55C-0.14AB-0.13AC+0.14BC-0.33A2-0.96B2-0.49C2。由表3可知，回归方程模型的P值为0.000 4＜0.01，表明该试验模型显著；失拟项P值为0.257 4＞0.05，说明方程对试验拟合程度良好，可以用此模型对糯高粱糖化工艺进行分析和预测。模型的决定系数R2=0.959 7，说明3因素对还原糖影响中95.97%的试验数据变异可用此模型解释。方程模型中加曲量、糖化温度、糖化时间3个因素均对还原糖含量有显著影响。回归方程的各项方差分析结果表明，糖化温度是影响糯高粱糖化效果的最显著因素，其次是糖化时间，加曲量在10%～20%范围内时对糖化工艺的影响最不显著。

表2 糖化工艺优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for saccharification process optimization

加曲量、糖化时间、糖化温度、各因素交互作用对糖化工艺的影响结果见图4。由图4可知，在糖化过程中，选择的参数范围内存在极值，相比较而言，糖化时间和糖化温度对糖化工艺的影响最为显著。由软件分析得到还原糖的最大响应值为17.32 g/100 mL，对应的加曲量为16.19%，糖化时间为25.49 h，糖化温度为55.27℃。

图4 各因素交互作用对还原糖含量影响的响应面与等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on reducing sugar contents

2.3 响应面优化条件验证试验

根据实际情况，选取工艺参数为加曲量16.2%，糖化时间25.5 h，糖化温度55.3℃。由表4可知，在此优化条件下，设3个重复，糖化后还原糖平均含量为17.29 g/100 mL，与理论值的相对误差为0.19%，验证试验表明，响应面法对糯高粱糖化工艺的优化是可行的，得到的糖化工艺条件具有实际应用价值。

表4 糖化工艺验证试验结果Table 4 Validation experiments results of saccharification process

2.4 黄酒总多酚、总黄酮含量与抗氧化性分析

将糖化完成的醪液自然冷却后加入糯高粱干质量0.5%的酿酒酵母，搅拌均匀，为使酿成的黄酒达到甜型黄酒标准，向糖化完成的醪液中加入体积分数为醪液7.5%的糟烧白酒（酒精度为75%vol），封口，置于18℃的恒温箱中后发酵45d，期间每隔一星期搅拌一次。将发酵完成后的醪液压榨过滤，于78℃灭菌30 min，调整酒精度为14%vol，制成成品糯高粱黄酒。

本研究对以糯高粱、黍米、藜麦3种杂粮为主要原料，采用相同的辅料、工艺酿造而成的3种黄酒进行分析，对比其多酚含量与抗氧化活性。酒样1为糯高粱黄酒，酒样2为黍米黄酒，酒样3为藜麦黄酒，均为实验室自制，测样前均调整酒精度为14%vol。

2.4.1 三种黄酒的品质指标

三种成品黄酒均具有黄酒特有的香气，口感香甜醇和，酒味浓郁，高粱黄酒色泽黄亮带红，清澈透明，黍米黄酒金黄发亮，清澈透明，藜麦黄酒带红亮透明，清澈透明。按照GB/T 13662—2008《黄酒》中给出的甜型黄酒测试方法对三种黄酒的相关指标测试，结果如表5所示，三种黄酒的相关理化指标均符合GB/T 13662—2008《黄酒》中传统甜型黄酒的限值规定。

表5 三种黄酒的理化指标Table 5 Physical and chemical indexes of three kinds of Chinese cereal wine

2.4.2 三种黄酒总多酚含量

图5 三种黄酒总多酚含量Fig.5 Total polyphenol contents in three types of Chinese cereal wine

以没食子酸为标准品，准确移取没食子酸质量为0、2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、16μg、20μg的标准品，按照实验方法处理后于765 nm处测其吸光度值，以吸光度值（y）为纵坐标，以没食子酸当量（x）为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为y=0.037 1x+0.009 9，R2=0.999 5。根据标准曲线回归方程计算出三个黄酒样品中总多酚含量（每个样品3次重复）。

三个黄酒样品中高粱黄酒的总多酚含量最高，为0.71 mg/mL，其次为藜麦黄酒0.69 mg/mL，黍米黄酒最低，为0.47 mg/mL。

2.4.3 三种黄酒总黄酮含量

以芦丁为标准品，准确移取芦丁当量为0.005mg、0.01mg、0.015 mg、0.02 mg、0.025 mg、0.03 mg、0.035 mg的芦丁标准液按照实验方法处理后于波长420 nm处测其吸光度值，以吸光度值（y）为纵坐标，以芦丁当量（x）为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为y=6.467 5x+0.004 7，R2=0.999 5。根据标准曲线回归方程计算出三个黄酒样品中总黄酮含量（每个样品3次重复）。

三种黄酒中总黄酮含量差异明显，藜麦黄酒中总黄酮含量最多，达到了7.39 mg/L，其次为高粱黄酒总黄酮含量1.12 mg/L，黍米黄酒总黄酮含量最低，为0.17 mg/L。

图6 三种黄酒总黄酮含量Fig.6 Total flavonoid contents in three types of Chinese cereal wine

2.4.4 三种黄酒抗氧化活性分析

图7 不同添加量的三种黄酒DPPH自由基清除率Fig.7 DPPH free radical scavenging rate of three kinds of Chinese cereal wine with different addition

根据实验方法测定三种黄酒的DPPH体外自由基清除率，结果见图7。由图7可知，表明三种黄酒都有一定的DPPH自由基清除能力，表现出一定的抗氧化活性。其中，高粱黄酒的抗氧化活性最强，当黄酒的加入量为80μL时已达反应平衡，当黄酒加入量为100μL时，DPPH自由基清除率为94.61%。其次是藜麦黄酒，当黄酒加入量为100μL时，总DPPH自由基清除率为71.45%。黍米黄酒的DPPH自由基清除能力最弱，当黄酒加入量为100μL时，DPPH自由基清除率为41.89%。

三种黄酒都含有一定量的总多酚、总黄酮，均表现出了比较强的自由基清除能力。高粱黄酒的总多酚含量与藜麦黄酒相差不大，黍米黄酒总多酚含量不及高粱与藜麦黄酒。藜麦黄酒总黄酮含量最高，是高粱黄酒的6.6倍，黍米黄酒的43.5倍，在体外DPPH自由基清除率方面，高粱黄酒的自由基清除能力最强，这与阙斐等[6]的研究结论——多酚含量越高，抗氧化能力越强，基本一致，但黄酒中还含有维生素C、维生素E及其他抗氧化活性物质，这也解释了高粱黄酒与藜麦黄酒多酚含量相近，但高粱黄酒的抗氧化性显著高于藜麦黄酒。黍米黄酒的总多酚、总黄酮含量都最低，其DPPH自由基清除能力也最弱。

3 结论

本研究通过单因素及响应面试验得到糯高粱酿造黄酒糖化工艺的最佳工艺条件为，加曲量为糯高粱干质量的16.2%，糖化时间25.5 h，糖化温度55.3℃，各因素对还原糖含量的影响次序依次为：糖化温度＞糖化时间＞加曲量。采用响应面法优化得到的工艺参数可靠，对实际糖化工艺有一定的指导意义。三种黄酒均含有总多酚、总黄酮，均具有一定的DPPH自由基清除活性，高粱黄酒总多酚含量最高，藜麦黄酒总黄酮含量最高。在抗氧化性方面，高粱黄酒的DPPH自由基清除率最高，比藜麦黄酒与黍米黄酒更具优势。

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