碱性蛋白酶对蛹虫草蛋白质水解的工艺技术优化研究

张新武，朱长文

（1.河南省食品工业科学研究所有限公司，郑州 450053；2.河南农业大学 食品科学技术学院，郑州 450002）

蛹虫草（Cordyceps militaris）是民间所谓的冬虫夏草或北虫草，其实是一种菌，归属于虫草的类别，它的药用、使用价值都很高，味甘、有益肺和止咳化痰、抗肿瘤等功效[1-3]。蛹虫草是一种橙黄透明的菌丝，呈管柱状、圆柱状、扁平状，有时从寄主的头部伸出、有时从节与节间生出[4]。蛹虫草的生长发育受到营养条件、温度、含水量、氧气等[5]外部因素影响。20世纪80年代后我国在世界上首次突破蛹虫草人工栽培技术，并大规模生产，随着蛹虫草研究开发的不断进行，国内许多厂家生产了保健品，产品投入市场后深受消费者喜爱，蛹虫草在未来将形成更大的产业[6]，但蛹虫草的化学成分复杂[7]，主要包括糖分、脂肪、蛋白质，其中涵盖了18种氨基酸、37种无机元素[8]，且栽培生产技术尚需不断完善和提高，生产技术也需进一步普及。蛹虫草中的蛋白质具有一般蛋白质的特点，也是大分子物质，不易被消化吸收，如何将蛹虫草中的蛋白质降解为小分子的肽类，且易于被人体吸收是今后的研究方向。目前蛹虫草蛋白质水解一般采用的酶是胰蛋白酶或中性蛋白酶[9]，利用碱性蛋白酶进行蛹虫草蛋白质水解工艺研究的文献未见报道[10]。碱性蛋白酶主要作用于具有芳香族或疏水性氨基酸的底物，其水解能力比中性蛋白酶或胰蛋白酶更强，且碱性蛋白酶具有一定的酯酶活力，其所得产物多肽分子质量会随着水解时间的延长而越来越小，酶解多肽得率高，有利于获得高产量的小分子蛹虫草多肽产品[11-12]。

本实验通过碱性蛋白酶酶解蛹虫草蛋白质并经蒸煮灭酶，用适当的方法计算出酶解得率和水解度（degree of hydrolysis，DH），最终得出较好的酶解条件和水解条件，经酶解、过滤、干燥等工艺处理后，酶解产物的分子质量小，酶解剩余物少，酶解得率高，可以进行产业化推广应用[13-16]，提高企业的生产效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草蛋白粉（蛋白质含量60%）：河南科腾生物科技有限公司；碱性蛋白酶（10 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司。甲醛、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3E型雷磁pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DS-1500型实验型喷雾干燥器：上海矩源机械设备有限公司；SHA-C型恒温振荡器：常州智博瑞仪器制造有限公司；TD25-WS型多管架自动平衡离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH-S4型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；LT/W2E型电子天平：常熟市天量仪器有限责任公司；FA2004N型电子天平：上海菁海仪器有限公司；RE52CS-1旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

原料→配制溶液→调节pH、温度等条件→酶解→蒸煮灭酶→离心→浓缩处理→喷雾干燥→产品

1.3.2 操作要点

称取蛹虫草蛋白粉并配制不同浓度底物的溶液，改变溶液pH值、温度等条件，添加碱性蛋白酶进行酶解处理，酶解期间控制pH值在8.2左右，酶解结束后85℃灭酶，蒸煮灭酶过后离心除去剩余物，将上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至一定浓度后喷雾干燥获得多肽产品。

1.3.3 单因素试验

采用单因素试验设计的方法，以下单因素试验重复3次，结果取其平均值。

（1）酶解时间对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

称取蛹虫草蛋白粉并配制底物浓度为8%的溶液，在碱性蛋白酶加酶量（以干料物质计算，下同）为1%，酶解pH值8.20，温度为50℃，振荡水浴锅振荡频率108 r/min，置于振荡水浴锅中酶解6 h、7 h、8 h、9 h、10 h，酶解期间，前3 h每隔30 min调节一次pH值，后期每隔1 h调节一次pH值并测定水解度，酶解结束后85℃灭酶14 h，灭酶过后取出，然后离心10 min（4 000 r/min），料液分离后，将上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至一定浓度后喷雾干燥获得多肽产品，称质量计算蛋白质酶解得率。

（2）底物浓度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

称取蛹虫草蛋白粉并配制五组底物浓度分别为6%、7%、8%、9%、10%的溶液，在碱性蛋白酶1%，酶解pH值8.20，温度为50℃，振荡水浴锅振荡频率108 r/min的条件下分别置于振荡水浴锅酶解8 h，酶解期间，前3 h每隔30 min调节一次pH值，后期每隔1 h调节一次pH值并测定水解度，酶解结束后85℃灭酶14 h，灭酶过后取出，然后离心10 min（4 000 r/min），料液分离后，将上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至一定浓度后喷雾干燥获得多肽产品，称质量计算蛋白质酶解得率。

（3）酶解温度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

称取蛹虫草蛋白粉并配制底物浓度为8%的溶液，分别控制酶解温度为44℃、47℃、50℃、53℃、56℃，在碱性蛋白酶1%，酶解pH值8.20，振荡水浴锅振荡频率108 r/min的条件下酶解8 h，酶解期间，前3 h每隔30 min调节一次pH值，后期每隔1 h调节一次pH值并测定水解度，酶解结束后85℃灭酶14h，灭酶过后取出，然后离心10min（4000r/min），料液分离后，将上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至一定浓度后喷雾干燥获得多肽产品，称质量计算蛋白质酶解得率。

（4）碱性蛋白酶加酶量对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

称取蛹虫草蛋白粉并配制底物浓度为8%的溶液，分别调节碱性蛋白酶添加量0.7%、1.0%、1.3%、1.6%、1.9%，在酶解pH值8.20，酶解温度为50℃，振荡水浴锅振荡频率108 r/min的条件下酶解8 h，酶解期间，前3 h每隔30 min调节一次pH值，后期每隔1 h调节一次pH值并测定水解度，酶解结束后85℃灭酶14 h，灭酶过后取出，然后离心10 min（4 000 r/min），料液分离后，将上清液用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩至一定浓度后喷雾干燥获得多肽产品，称质量计算蛋白质酶解得率。

1.3.4 蛹虫草蛋白质水解工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上设计了正交试验，确定酶解时间、底物浓度、酶解温度、加酶量4个因素对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响，试验因素水平见表1。

表1 蛋白质水解工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for protein hydrolysis process optimization

1.3.5 分析方法

（1）氨基酸总量（氨基酸态氮）的测定[17]

首先量取5 mL水解蛋白液倒入250 mL烧杯中，再加入60 mL已除去CO2的蒸馏水，用干净的搅拌棒搅拌均匀。随后滴入0.1 mol/L NaOH，直至pH值为8.2。然后加入已中和的甲醛溶液20.0 mL，并且记录当pH值为9.2时对应消耗的NaOH体积，记为V1。最后按相同操作方法做空白对比实验，过程中记录对应pH数值所消耗的NaOH体积，记为V2。水解蛋白液中蛋白质的氨基酸态氮含量计算公式如下：

h=1 000×M（V1-V2）/（V×C）

式中：h为水解蛋白液氨基酸态氮含量，mmol/g；M为NaOH标准溶液的浓度，mol/L；V1为滴定样品稀释液消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；V2为空白消耗的NaOH标准溶液的体积，mL；C为所用蛋白质溶液的蛋白质质量浓度，g/L；V为用于甲醛滴定的水解液体积，mL。

（2）水解度的测定

采用甲醛滴定法[18-19]，水解度计算公式如下：

DH=h/htot×100%

式中：DH为水解度，%；h为水解蛋白液氨基酸态氮含量，mmol/g；htot为水解前蛋白液氨基酸态氮含量，mmol/g（现有资料显示，htot是一个常数，蛹蛋白的氨基酸态氮含量为7.8 mmol/g[20]）。

（3）蛋白质酶解得率的计算

蛹虫草蛋白水解结束，经离心机将料液分离，对上清液进行喷雾干燥，计算蛋白质酶解得率，计算公式如下：

蛋白质酶解得率=m1/m×100%

式中：m1为上清液喷雾干燥质量，g；m为原料质量，g。

（4）肽分子质量分布的测定[21-22]

参照GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》中的高效液相色谱方法进行分子质量测定，直观的了解产品的分子量分布情况。

2 结果与分析

2.1 单因素对蛹虫草蛋白质水解工艺的影响

2.1.1 酶解时间对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

酶解时间对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响结果见图1。由图1可知，酶解时间越长，酶解得率和水解度都随之增大。在6～8 h时，速率增加的最快。酶解时间对水解度和酶解得率大小存在显著性差异（P＜0.05）；当达到8 h后，水解度和酶解得率都趋于平缓上升状态，当达到8 h后，两者都达到稳定状态。由于6～8h变化较大，且6h的酶解得率和水解度都较低，所以在设计正交试验时取8 h、9 h、10 h作为正交试验水平。

图1 酶解时间对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.1.2 底物浓度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

底物浓度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响见图2。由图2可知，酶解得率和水解率随着底物浓度的增加呈下降趋势，当底物浓度为7%～8%时，底物浓度大小对水解度和酶解得率大小影响显著（P＜0.05）。由于酶的添加量固定，低底物浓度有利于提高水解度和酶解得率，高底物浓度时水解度和酶解得率反而下降，水解度为6%时最高，所以取底物浓度为6%、7%、8%作为正交试验水平。

图2 底物浓度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.1.3 酶解温度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

酶解温度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响见图3。由图3可知，酶解温度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响较大，随着酶解温度的增加，水解度和酶解得率都呈上升趋势。当酶解温度低于50℃时，水解度和酶解得率的上升趋势较大，酶解温度的高低对水解度和酶解得率大小均差异明显（P＜0.05）；当酶解温度高于50℃时，酶解得率上升趋势不大，趋于稳定；当温度高于53℃，水解度大小差异不显著（P＞0.05）。因此，取酶解温度为50℃、53℃、56℃作为正交试验水平。

图3 酶解温度对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.1.4碱性蛋白酶添加量对蛹虫草蛋白质水解度和酶解得率的影响

碱性蛋白酶添加量对蛹虫草蛋白质水解度和得率的影响见图4。由图4可知，碱性蛋白酶的添加量对蛹虫草蛋白质水解度和得率的影响较大，随着酶的添加量的增加水解度和酶解得率呈上升趋势，当酶的添加量＜1.3%时，水解度和酶解得率上升趋势较大，酶的添加量大小对酶解得率大小差异显著（P＜0.05）；当酶的添加量＞1.3%时，水解度和酶解得率趋于平缓上升状态，对酶解得率大小影响不大（P＞0.05）；因此，取碱性蛋白酶添加量为1.3%、1.6%、1.9%作为正交试验水平。

图4 碱性蛋白酶加酶量对蛹虫草蛋白质水解度和得率的影响Fig.4 Effect of alkaline protease addition on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.2 碱性蛋白酶对蛹虫草蛋白质水解工艺的正交试验优化

在单因素试验的基础上进行正交试验，以酶解时间、底物浓度、酶解温度、碱性蛋白酶添加量为评价因素，水解度和酶解得率为评价指标进行正交试验，正交试验结果与分析见表2，方差分析分别见表3和表4。

表2 蛋白水解工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for protein hydrolysis process optimization

续表

从正交试验结果分析可知，影响水解度效果的因素为A＞D＞C＞B，由表2可以得出蛹虫草水解度最高的一组是A3B3C2D1，即酶解时间为10 h、底物浓度为8%、酶解温度为53℃、碱性蛋白酶的添加量为1.3%，此时的水解度为15.01%。

影响酶解得率效果的因素A＞C＞D＞B，由表2可以得出蛹虫草酶解得率最高的一组是A1B3C3D3，即酶解时间8 h、底物浓度为8%、酶解温度56℃、碱性蛋白酶的添加量为1.9%，此时的酶解得率为75.27%，由此可以得出正交试验优化条件就是这两组组合，所以企业在生产过程中，可以根据生产需求选择合适的优化条件，提高产品利用率和企业效益。

表3 以水解度为评价指标的正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using hydrolysis degree as evaluation index

表4 以蛋白质酶解得率为评价指标的正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using protein hydrolysis yield as evaluation index

由表3可知，在酶解时间、底物浓度、加酶量以及水解温度几个变量中，酶解时间对蛋白质水解度带来的影响显著（P＜0.05），其他因素影响不显著。由表4可知，酶解时间对蛹虫草蛋白质水解的酶解得率有显著性影响（P＜0.05），而底物浓度、加酶量和酶解温度对酶解得率的影响不显著（P＞0.05），这说明要提高蛹虫草蛋白质水解的水解度和酶解得率，控制酶解时间尤为关键。

2.3 肽分子质量分布的测定结果

蛹虫草蛋白粉经碱性蛋白酶酶解、过滤、干燥等工艺处理后，采用高效液相色谱法对酶解产物的分子质量分布进行测定，肽分子质量峰面积分布结果见图5和表5。

图5 肽分子质量峰面积分布图Fig.5 Distribution figure of peak area of peptide molecular mass

表5 肽分子质量分布范围Table 5 Distribution range of peptide molecular mass

由图5和表5所示，通过高效液相色谱分析可知，水解浓缩物处理后肽相对分子质量＜2 000 Da的占峰值面积的90.8%，主要分布区域为分子质量＜500 Da，占峰面积的55.1%，结果表明，碱性蛋白酶水解蛹虫草蛋白质后肽的分子质量分布大多＜500 Da，效果较理想。

3 结论

试验结果表明，当酶解温度为53℃、底物浓度为8%，碱性蛋白酶添加量1.3%，酶解时间10 h时，水解度最高，为15.01%。当底物浓度为8%、碱性蛋白酶添加量为1.9%，酶解时间8 h、酶解温度为56℃时，酶解得率最高，为75.27%。经碱性蛋白酶酶解、过滤、干燥等工艺处理后，水解浓缩物相对分子质量＜2000Da的占峰值面积的90.8%，肽分布区域为分子质量＜500 Da；酶解剩余物较少，得率高，但酶解液颜色较深，生产中可以考虑用碱性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，以达到更好的生产效益。

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