响应面法优化无花果叶总黄酮超声辅助提取工艺

马金菊，孙江飞，武文浩，高峰青*

（1.黄河水利职业技术学院 环境与化学工程系，河南 开封 475004；2.开封市绿色涂层材料重点试验室，河南 开封 475004；3.国家安全生产监督管理总局培训中心，北京 100012）

无花果（Ficuscarica）叶为桑科植物无花果的叶，分布在我国中部、西北部、南部诸省，其具有极高的药用价值。无花果叶中含有糖类、黄酮、果胶和维生素等有效化学物质，具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等功效[1-3]。

黄酮提取方法有很多种，目前比较常见的有浸提法、双水相提取法、半仿生提取法、大孔树脂吸附法、超声提取法等。浸提法较为成熟，但效率低，提取缓慢，所需溶剂量过多[4-5]；双水相提取法分相快，易操作，提取率高，但其消耗成本大[6]；半仿生提取法生产周期短，降低成本，但易引起成分变化[7]；大孔树脂吸附法吸附速度快，选择性好，但操作复杂，工艺要求较高[8-11]；超声提取法速度快，提取效率高，溶剂使用量少[12-15]。因此本试验利用超声辅助法探讨无花果叶中总黄酮的提取工艺，将单因素试验和响应面试验设计优化法相结合，以建立一种高效、清洁、经济、实用的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无花果叶：河南开封市近郊；芦丁标准品（色谱纯）：中国药品生物制品鉴定所本试验所；无水乙醇（分析纯）：安徽安特食品股份有限公司；亚硝酸铝（分析纯）：焦作市化工三厂；氢氧化钠、硝酸铝（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；2,2'-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、Tris-HCl、邻苯三酚（均为分析纯）：合肥博美生物科技有限责任公司；HCl（分析纯）：洛阳昊华化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；KQ-100E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵：河南智诚科技发展有限公司；FA2004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；101-1A电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声辅助提取

将无花果叶洗净、烘干、破碎并过筛，置于棕色瓶备用。取一定量的样品，加入相应体积分数的乙醇，搅拌并静置15 min，在不同功率下，选择不同的提取时间，制得待测样品液。对试验进行多次平行，取算术平均值[16]。

1.3.2 无花果叶总黄酮提取率的测定

准确称取0.020 0 g芦丁标准品，配制成质量浓度为0.20 mg/mL的标准溶液。移液管移取0、2.50 mL、5.00 mL、7.50 mL、10.00 mL、12.50 mL、15.00 mL此溶液于25 mL容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液1.00 mL、10%Al（NO3）3溶液1.00 mL和4%NaOH溶液10.00 mL，每次加入试剂后均摇匀静置5min，接着定容至25mL容量瓶中，摇匀并静置15min。质量浓度依次为0、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL、0.12 mg/mL的芦丁标准溶液，于波长505 nm处测定吸光度值[17]。

1.3.3 无花果叶中总黄酮提取率的计算

总黄酮提取率计算公式如下：

式中：Y为样品中总黄酮提取率，mg/g；C为无花果叶中黄酮类化合物的质量浓度，mg/mL；V1为稀释体积，mL；V2为样品溶液体积，mL；m为样品质量，mg；V3为取样体积，mL。

1.3.4 总黄酮提取条件优化单因素试验

分别以液料比、超声时间、乙醇体积分数、超声温度为影响因素，设置4个因素的不同水平，分析不同提取条件对无花果叶中总黄酮提取率的影响。

1.3.5 响应面优化试验设计

依据单因素试验结果，采用Box-Benhnken Design（BBD）法设计4因素3水平的试验，因素按照顺序分别是：液料比（A）、超声时间（B）、乙醇体积分数（C）、超声提取温度（D）；-1、0、1（代表每个自变量的低、中、高水平）；无花果叶中总黄酮的提取率（Y）作为响应值，因素与水平编码见表1。

表1 总黄酮提取条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for total flavonoids extraction conditions optimization

1.3.6 抗氧化活性测定

以ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除率来考察无花果叶中总黄酮的抗氧化性。

（1）ABTS自由基的清除

参照韩光亮等[18]的方法，以分光光度法测定ABTS自由基清除率。取不同体积分数样品液2.00 mL，与8.00 mL ABTS使用液混合，混匀，置于暗处30min，以蒸馏水作参比，于波长517nm处测定吸光度值。ABTS自由基清除率计算公式如下：

式中：A0为样品液和ABTS+溶液吸光度值；A1为ABTS+溶液吸光度值；A2为不含ABTS+溶液时样品液吸光度值。

（2）超氧阴离子自由基的清除

参照李加兴等[19]的方法，以分光光度法测定超氧阴离子自由基清除率。取不同体积分数样品液1.00 mL，各加入4.50 mLTris-HCl缓冲液和0.10 mL邻苯三酚，反应5 min后加入1.00 mLHCl溶液终止反应，混匀，以蒸馏水作参比，于波长299 nm处测定吸光度值。超氧阴离子自由基清除率计算公式如下：

式中：A1为样品液和含邻苯三酚溶液吸光度值；A2为不含邻苯三酚溶液样品液吸光度值；A3为含邻苯三酚溶液吸光度值。

（3）数据处理

参照王彦平等[18-19]的方法，采用Origin7.5软件对试验数据制图，分析单因素试验结果；使用Design-Expert8.0.6软件进行响应面结果分析和图形输出。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制芦丁标准曲线如图1所示。由图1可知，芦丁标准曲线回归方程为：Y=9.267 9X+0.008 9，相关系数为R2=0.999 3。表明该标准曲线在0～0.10 mg/mL范围内呈良好线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对无花果叶总黄酮提取率的影响

由图2可知，液料比＜30∶1（mL∶g）时和总黄酮提取率关系呈现为正相关，之后呈现为负相关。液料比在30∶1（mL∶g）时，总黄酮提取率最大。推测其原因可能是水加入使样品充分溶胀，使样品和溶剂的接触面积增加，导致了总黄酮的提取率也增加。因此，液料比确定为30∶1（mL∶g）。

图2 液料比对无花果叶总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

2.1.2 超声时间对无花果叶总黄酮提取率的影响

图3 超声时间对无花果叶总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasound extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

由图3可知，总黄酮提取率随着超声提取时间的延长呈现为正相关，超声提取时间25min时总黄酮提取率最大，超声时间25 min后呈现为负相关。由于超声时间较长，可能导致乙醇挥发较快，导致提取率下降。因此，超声时间确定为25 min。

2.1.3 乙醇体积分数对无花果叶总黄酮提取率的影响

图4 乙醇体积分数对无花果叶总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

由图4可知，总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加呈现为正相关，在乙醇体积分数为70%时最高，总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加而呈现为负相关，推测是由于乙醇体积分数较高时，一些原料中其他物质也被乙醇溶解从而影响试验效果，因此，乙醇体积分数确定为70%。

2.1.4 超声温度对无花果叶总黄酮提取率的影响

由图5可知，当超声温度＜70℃时提取率呈现为正相关，之后呈现为负相关，推测可能是乙醇挥发较快，无花果叶中黄酮物质不能充分被溶解，因此，超声温度选择70℃。

图5 超声温度对无花果叶总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasound extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

2.2 响应面法优化工艺条件

2.2.1 响应面试验设计及结果

根据响应面设计原理和表因素编码表，无花果叶中黄酮的提取率（Y）为响应值，使用Design-Expert8.0.6软件进行结果分析。具体响应面试验设计和分析结果如表2所示。

表2 总黄酮提取条件优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface methodology for total flavonoids extraction conditions optimization

续表

2.2.2 模型的建立及方差分析[20-21]

采用Design-Expert8.0.6软件将试验模型进行显著性检验和方差分析，结果见表3。经回归拟合后，由响应面分析法得出关于超声辅助法提取总黄酮得率的二次回归拟合方程：

表3 多元回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of multiple regression model

由表3可知，失拟项F值=28.65，P＞0.05说明相对于纯误差失拟不显著。获得回归模型线性回归方程相关系数R2=0.966 3，说明96.63%响应值的变化是由独立变量决定。此外，模型变异系数（coefficient of variation，CV）=0.87%，证明该试验值精密度及可靠性可以用。因此，该模型总体拟合具有统计学意义，无花果叶中总黄酮提取最佳工艺可以用此方案预测。根据F值的大小，推测出本试验几个影响因素的重要性为超声时间（B）＞超声温度（D）＞液料比（A）＞乙醇体积分数（C）。

2.2.3 响应面分析

图6 超声温度、超声时间、乙醇体积分数及液料比的交互作用对无花果叶总黄酮提取率影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasound temperature,time,ethanol concentration and liquid-solid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Ficus carica leaves

用Design-Expert8.0.6软件绘制以黄酮提取率为响应值的各因子交互作用的响应曲面图，发现超声温度与液料比、超声温度与超声时间两组交互性相对较弱。而超声温度与乙醇体积分数、乙醇体积分数与超声时间、乙醇体积分数与液料比、超声时间与液料比四组交互性较强，结果见图6。

由图6A可知，提取率随着乙醇体积分数的增大而增大，在乙醇体积分数70%时达到最大值，而后开始下降。超声温度呈现先上升后下降的趋势。等高线呈椭圆形，说明乙醇体积分数与超声温度的交互影响较为显著。由图6B可知，随着乙醇体积分数增加，提取率也呈增加趋势，且在乙醇体积分数70%时达到最高值，然后下降。超声时间也呈现先上升后下降的趋势。由图6C可知，随着乙醇体积分数的增加，提取率也呈先上升后下降的趋势。液料比的变化趋势也与之相似。说明乙醇体积分数与超声时间、液料比的影响较大，表现为曲线更为陡峭。等高线呈扁椭圆型趋势。由图6D可知，随着超声时间的增加，提取率随液料比的增加呈现先升高后下降的趋势，表明超声时间与液料比对试验的影响最大，等高线呈更为扁平的椭圆形，表明超声时间与液料比的交互作用最为显著，因此曲线最为陡峭。由此可见，超声时间与液料比的交互作用最为显著。

2.3 最优工艺及验证试验

分析回归模型，得出最佳提取条件为：乙醇体积分数70.25%，液料比29.88∶1（mL∶g），超声时间25.23 min，超声温度69.52℃模型预测总黄酮提取率为27.384 mg/g。优化模拟结果，得到最佳工艺条件：乙醇体积分数70%，液料比30∶1（mL∶g），超声时间25 min，超声温度70 ℃，进行3次平行试验，得到总黄酮提取率平均值为27.379 mg/g。与模型预测值基本一致，说明所得模型可以用来预测无花果叶中总黄酮提取率。

2.4 抗氧化试验结果

2.4.1 对ABTS自由基的清除

考察无花果叶中总黄酮对ABTS自由基的去除能力，当提取液质量浓度在10.00 mg/mL时自由基的去除率达到最高65.23%，也证明了无花果叶黄酮类物质具有较好的抗氧化性。

2.4.2 对超氧阴离子自由基的清除

考察无花果叶中总黄酮对超氧阴离子自由基的去除能力，当提取液质量浓度为4.00 mg/mL时自由基的去除率达到最高73.21%，也证明了无花果叶黄酮类物质具有较好的抗氧化性。

3 结论

经Design-Expert8.0.6优化，检验确定最佳工艺条件为乙醇体积分数70%，液料比30∶1（mL∶g），超声时间25 min，超声温度70℃，模型预测总黄酮提取率为27.384mg/g。依据响应面要求优化后总黄酮提取率算数平均值为27.379mg/g，二者一致性较好，说明所得模型可以用于无花果叶黄酮提取工艺的优化。研究发现无花果叶中黄酮提取液对ABTS自由基清除率最高65.23%，对超氧阴离子自由基清除率最高73.21%，证明该提取物具有较强的抗氧化能力。

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