蓝莓酵素发酵工艺优化

刘 鑫，朱 丹，牛广财*，魏文毅，张 琪，樊秋元

（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319）

蓝莓（Vaccinium spp.）又名越橘、蓝浆果，属杜鹃花科越橘属多年灌木果树[1]，有较强的保健功效，常被誉为“水果之王”[2]。果实中不仅含脂肪、蛋白质、碳水化合物、维生素及诸多微量元素[3]等营养成分，花青素、多酚类物质、黄酮类物质及熊果酸含量也很高[4]。具有保护视力、抗氧化、治疗心脑血管疾病、增强记忆力等保健功能[5-8]。

酵素是指使用酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等有益微生物发酵果蔬及可食性药材而得到的固体或者液体食品，富含大量的脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶、乳酸、醋酸及少量乙醇等代谢产物[9-10]。通常酵素产品含有氨基酸、维生素、β-胡萝卜素、功能性低聚糖、有机酸和多酚等多种营养成分[11-14]。益生菌的代谢反应直接影响酵素产品的品质，故对益生菌的选择及其发酵方式的研究具有重要意义，目前已从自然发酵的酵素中分离出乳酸菌[15]、酵母菌[16-17]、醋酸菌[18]等多种益生菌，杜丽平等[19]采用聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术分析木瓜酵素自然发酵过程微生物的变化规律，研究认为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（Pichia pastoris）为发酵优势菌种。果蔬等经过益生菌的发酵含有蛋白酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、脂肪酶、淀粉酶等多种功效酶，蛋白酶可降解食物中蛋白质利于人体吸收，并对人体中凋亡的细胞具有清除的作用[20]。超氧化物歧化酶是体内天然的超氧自由基清除因子，具有抗衰老、抗氧化的多种保健功能。刘敏等[21]对多种蔬菜水果为原料制备的酵素产品进行了研究，结果表明蛋白酶活力、纤维素酶活力、脂肪酶活力均比较高，并具有良好的抗氧化性。杨培青等[22]对蓝莓果渣酵素的工艺进行了研究，经干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）与酵母菌复合发酵获得了酵素产品，使资源得到了有效利用。战伟伟等[23]以蓝靛果、椰子为原料，经双歧杆菌（Bifidobacterium）与酵母菌发酵后得到了一种新型的复合酵素。本研究以蓝莓为原料，植物乳杆菌（L.plantarum）与酵母菌作为发酵菌种制备蓝莓酵素，以蛋白酶活力及SOD酶活力为评价指标，探究蓝莓酵素最佳的制备工艺条件，以期为改进蓝莓酵素的加工工艺提供理论依据，对蓝莓资源的高效利用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓：黑龙江省大庆市农贸市场；安琪牌葡萄酒专用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）：中科院微生物研究所；白砂糖：黑龙江北方糖业股份有限公司；SOD酶活力检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；干酪素（分析纯）：天津市化学试剂供销公司；L-酪氨酸（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；福林酚试剂、酚酞（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；Pectinex XXL果胶酶（酶活10 000 U/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

WS108型手持糖度计：上海测维光电技术有限公司；HWS24电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；EX324电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡离心机：金坛市城西春兰试验仪器厂；UV-1100紫外可见分光光度计：上海凌析达仪器有限公司；HR7633打浆机：飞利浦家庭电器（珠海）有限公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌锅：杭州亚旭生物科技有限公司；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓酵素加工工艺流程及操作要点

操作要点：

（1）酶解

蓝莓清洗破碎之后经Pectinex XXL果胶酶酶解，果胶酶添加量为1.6 mL/kg，置于50℃水浴中酶解2 h。

（2）调糖

在蓝莓果汁中直接添加白砂糖调整糖度，在室温条件下利用手持糖度仪进行糖度测定，调整糖度至18%。

（3）菌种活化

酵母菌活化：将安琪牌活性干酵母用10倍蒸馏水溶解，30～35℃恒温水浴锅中活化30 min备用；植物乳杆菌活化：将斜面保藏的植物乳杆菌在MRS肉汤培养基中活化，两次继代培养后，37℃条件下静置培养48 h，备用。

（4）杀菌

采用巴氏杀菌的方式对蓝莓果汁进行杀菌，85℃杀菌15 min后冷却至室温。

（5）接种

向处理后的蓝莓果汁中，按试验要求的比例接入活化后的植物乳杆菌或酵母菌。

（6）发酵

接种后的蓝莓果汁，在试验要求的温度和时间等条件下进行静置发酵，发酵结束后测定蛋白酶活力与SOD酶活力。

1.3.2 植物乳杆菌发酵单因素试验

（1）发酵时间的确定

调整发酵初始糖度为18%，杀菌冷却后接入3%的植物乳杆菌，37 ℃条件下发酵1 d、2 d、3 d、4 d，测定蛋白酶活力与SOD酶活力确定植物乳杆菌发酵蓝莓酵素的最佳发酵时间。

（2）发酵温度的确定

将发酵初始糖度调整为18%，蓝莓杀菌处理后接入3%的植物乳杆菌，发酵温度确定为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，发酵时间为2 d，根据蛋白酶与SOD酶活力大小确定植物乳杆菌发酵蓝莓酵素的最佳发酵温度。

（3）接种量的确定

将发酵初始糖度调节为18%，分别接入2%、3%、4%、5%、6%的植物乳杆菌，37℃条件下发酵2 d，测定蛋白酶与SOD酶活力，根据酶活力大小确定植物乳杆菌最佳的接种量。

1.3.3 植物乳杆菌发酵正交试验

在植物乳杆菌发酵蓝莓酵素单因素试验的基础上，以发酵时间、发酵温度以及接种量3个因素为考察对象，以蛋白酶活力与SOD酶活力为评价指标，确定植物乳杆菌发酵蓝莓酵素的最佳工艺条件。

表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 蓝莓酵素的发酵方式

通过探究酵母菌与植物乳杆菌复合菌种的发酵，研究确定乳酸发酵与酵母发酵的先后顺序，通过以下三种方式进行，测定发酵液的蛋白酶与SOD酶活力，依据酶活力高低选取最佳发酵方式。

发酵方式1：先进行乳酸发酵，接入4%的植物乳杆菌，在39℃条件下发酵1d，后接入0.15%的酵母菌，28℃条件下发酵3 d。

发酵方式2：先接入0.15%的酵母菌，28℃条件下发酵3 d，后进行乳酸发酵，接入4%的植物乳杆菌，在39℃条件下发酵1 d。

发酵方式3：同时接入4%植物乳杆菌与0.15%酵母菌，在34℃条件下发酵4 d。

1.3.5 检测指标及测定方法：

蛋白酶活力测定方法参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》，采用福林酚法测定蛋白酶活力；SOD酶活力的测定：蓝莓酵素液离心取上清液，根据SOD酶试剂盒说明书进行酶活力的测定；可溶性固形物含量的测定：采用折光计法；总酸的测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；总花色苷含量的测定：花色苷pH=1时在波长520nm处有最大吸收峰，利用花色苷结构特性，在pH=4.5时结构转变为查尔酮形式而无吸收峰，采用pH示差法测定蓝莓酵素中总花色苷含量[24]。

大肠菌群数测定：参照GB 4789.3—2010《大肠菌群计数》；金黄色葡萄球菌数测定：参照GB 4789.10—2010《金黄色葡萄球菌检验》；菌落总数测定：参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验菌落总数测定》。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵单因素试验

2.1.1 发酵时间对酶活力的影响

由图1可知，发酵前，蓝莓鲜果中自带的SOD酶酶活为21.92 U/g，蛋白酶活力为13.37 U/mL。随着发酵时间的进行，SOD酶活力不断增加，且发酵的第1天SOD酶活力上升速率很大，第2天酶活力达到最大值86.01 U/g；发酵进行到第3天，由于发酵液中总酸不断上升，抑制了植物乳杆菌的生长及功效酶活力，SOD酶活力有明显下降趋势。随着发酵的进行，蛋白酶活力不断上升，在发酵的第2天蛋白酶活力达到最高值31.28 U/mL；随着发酵时间延长，由于发酵产物的影响，蛋白酶的活力出现了下降的趋势。因此，植物乳杆菌发酵蓝莓酵素的最适发酵时间为2 d。

图1 发酵时间对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Fig.1 Effect of fermentation time on protease activity and SOD activity of blueberry enzyme

2.1.2 发酵温度对酶活力的影响

由图2可知，随发酵温度增加，SOD酶活力呈缓步上升的趋势，39℃条件下，SOD酶活力达到最大值58.28 U/g；发酵温度高于39℃，不利于植物乳杆菌生长，SOD酶活力降低。发酵温度33℃时，温度过低不利于乳酸发酵产生蛋白酶；发酵温度＞37℃，蛋白酶活力显著上升，在39℃时，蛋白酶活力达到最高值39.44 U/mL，发酵温度＞39℃，由于温度过高，蛋白酶活力下降。植物乳杆菌发酵蓝莓酵素的最适发酵温度为39℃。

图2 发酵温度对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on protease activity and SOD activity of blueberry enzyme

2.1.3 接种量对酶活力的影响

由图3可知，接种量增加到3%，SOD酶活力达到最大值86.01 U/g；随着接种量的不断增加，植物乳杆菌繁殖速率过快，发酵液营养物质消耗过快，且有机酸含量过高，使得SOD酶活力降低。蛋白酶活力随接种量的不断增加呈现缓慢上升趋势，接种量达到4%时，蛋白酶活力达到最高值24.48 U/mL，接种量＞4%，蛋白酶活力稍有下降而后趋于稳定。根据两种功效酶综合活力高低，植物乳杆菌的最适接种量为3%。

图3 接种量对蓝莓酵素蛋白酶活力与SOD酶活力的影响Fig.3 Effect of inoculum on protease activity and SOD activity of blueberry enzyme

2.2 正交试验优化发酵工艺条件

由表2极差R值可知，植物乳杆菌发酵蓝莓酵素，蛋白酶活力与SOD酶活力高低的影响因素主次顺序均为C＞A＞B，由表3可知，以蛋白酶活力为评价指标，发酵时间对蛋白酶活力的影响显著（P＜0.05），发酵温度及接种量对蛋白酶活力的影响不显著（P＞0.05）；由表4可知，以SOD酶活力为评价指标，发酵时间对SOD酶活力的影响极显著（P＜0.01），接种量对SOD酶活力的影响显著（P＜0.05），发酵温度对SOD酶活力无显著性影响（P＞0.05）。根据正交试验优化的结果可知，最优发酵工艺条件组合为A3B2C1，即发酵时间为1 d，接种量为4%，发酵温度为39℃。在此最佳条件下，蛋白酶活力与SOD酶活力分别为39.44 U/mL和84.17 U/g。

表2 发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

表3 以蛋白酶活力为评价指标的正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using protease activity as evaluation index

表4 以SOD酶活力为评价指标的正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using SOD activity as evaluation index

2.3 蓝莓酵素发酵方式比较

图4 不同发酵方式对蛋白酶及SOD酶活力的影响Fig.4 Effects of different fermentation methods on protease and SOD activity

由图4可知，发酵方式1蛋白酶活力最低，而SOD酶活力较高，由植物乳杆菌发酵蓝莓酵素单因素试验可知乳酸发酵可显著提升SOD酶活力，显著高于蛋白酶活力上升效果，故先进行乳酸发酵样品SOD酶活力较高，然而乳酸发酵对营养物质的消耗较快不利于酵母菌发酵的进行，导致蛋白酶活力较低；发酵方式2蛋白酶活力明显高于发酵方式1，而SOD酶活力略低于发酵方式1，这是由于先进行的酵母菌发酵产生了酒精（此时酒精度为1.68%vol），一定程度上抑制了植物乳杆菌的生长代谢，致使蛋白酶活力与SOD酶活力较低。发酵方式3中酵母菌与乳酸菌共同发酵，两种菌种很可能形成了一种共生机制，酵母菌分泌出的蛋白酶、脂肪酶及营养因子可促进乳酸发酵的进行；而乳酸菌代谢的乳酸盐等物质可作为能源物质为酵母菌所用[25]，故发酵方式3即酵母菌与乳酸菌共同发酵是最佳的发酵方式。与单独植物乳杆菌发酵的蓝莓酵素蛋白酶活力（39.44 U/mL）和SOD酶活力（84.17 U/g）相比，复合菌种发酵的蓝莓酵素蛋白酶活力为55.76 U/mL，SOD酶活力81.27 U/g。说明复合菌种发酵的蛋白酶活力明显高于植物乳杆菌单独发酵的样品，SOD酶活力略低于植物乳杆菌单独发酵。因此，复合菌种发酵蓝莓酵素的两种功效酶综合活力高于植物乳杆菌单独发酵。

2.4 蓝莓酵素的品质指标

2.4.1 感官指标

色泽：紫红色，色泽均匀有光泽；口味：细腻绵柔，微酸不刺激；香气：有蓝莓独特香味，同时伴有发酵香气；组织状态：液态，均匀无结块，无沉淀及悬浮物。杂质：无外来杂质。

2.4.2 理化指标

可溶性固形物含量为6.0%，总酸含量为7.24 g/L，总花色苷含量为3.06 mg/g，SOD酶活力81.27 U/g，蛋白酶活力55.76 U/mL。

2.4.3 微生物指标

细菌总数为≤10CFU/mL，大肠杆菌总数＜3MPN/100mL，致病菌未检出。

3 结论

研究结果表明，植物乳杆菌单独发酵与复合菌种发酵均可显著提高蓝莓酵素中蛋白酶与SOD酶的活力。经植物乳杆菌单独发酵的最优工艺为发酵时间为1d，接种量为4%，发酵温度为39℃，该条件下蓝莓酵素的蛋白酶活力及SOD酶活力分别为39.44U/mL和84.17U/g。采用同时接入4%植物乳杆菌与0.15%酵母菌，在34℃条件下发酵4 d，蓝莓酵素的蛋白酶活力与SOD酶活力最高，分别达到了55.76 U/mL和81.27 U/g。综上所述，复合菌种发酵是制备蓝莓酵素的最佳方式。

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