烟碱对腹腔感染败血症小鼠的保护作用及其机制研究*

贾宝辉，刘宁，陈奕，黄敏，尚明升，杜玉明

（1.郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 451460；2.南昌大学第四附属医院 重症医学科，江西 南昌 330003；3.郑州大学第一附属医院 重症医学科，河南 郑州 450052）

致病菌入侵机体时，体内的迷走神经释放递质乙酰胆碱与免疫系统相互作用参与抗炎，即胆碱能抗炎通路[1]。烟碱是烟碱型乙酰胆碱受体α-7亚基（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7AchR）特异性激动剂，通过与α7AchR结合，比乙酰胆碱抗炎效应更强[2]。本研究应用烟碱激活胆碱能抗炎通路，观察其对败血症小鼠生存率、败血症严重程度，以及肝、肺组织病理学、血浆促炎症细胞因子水平的影响，探讨烟碱对败血症的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康昆明小鼠，雌性，体重20～25 g（南昌大学医学院实验动物中心提供）。采用盲肠结扎并穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法复制败血症动物模型。65只小鼠随机分为对照组（15只）、CLP组（20只）和烟碱400μg/kg组（30只），用于观察生存率和记录平均生存时间。另取18只小鼠分组同上，每组6只，用于观察一般状况，20 h处死动物记录大体形态学，计算肺湿干重比、败血症严重程度评分，取肝、肺组织行病理学检查。另取120只小鼠随机分为对照组、CLP组，以及烟碱400、200和40μg/kg组，每组24只，用于测定血浆促炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）水平。模型复制成功后，立即腹腔注射不同浓度烟碱或等量生理盐水，之后每隔8 h追加注入，连续3 d共9次。

1.2 小鼠败血症模型的复制

参考文献[3]复制败血症小鼠模型。术前禁食12 h，腹腔注射7%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉。于左下腹做长约1.5cm切口，游离肠系膜和盲肠，以4号丝线环行结扎盲肠根部，用12号针头于距盲端1cm处贯通穿刺，挤出粪便少许，还纳肠系膜和肠管。逐层缝合关腹，碘伏消毒伤口。术毕皮下注射生理盐水3 ml/100 g，并肌内注射青霉素2万u预防切口感染。对照组除开腹、游离并还纳肠系膜及盲肠、缝合关腹外，不行CLP，其余处理同CLP组。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 生存率记录对照组、CLP组和烟碱400μg/kg组小鼠24、36和48 h存活例数及生存率。共观察7 d。

1.3.2 肺湿干重比CLP后20 h处死动物，分离双侧肺组织，取右侧肺组织于纱布上吸净血液，称湿重后于65℃烤箱中24 h至恒重，称干重，计算肺湿干重比。

1.3.3 败血症严重程度评分小鼠CLP后败血症严重程度评分采用改良的评定标准[4]进行。从一般情况、肠管情况、腹水情况、结扎盲肠情况、病灶包裹情况、肝脏体积及肺湿干重比7个方面进行评定。见表1。

1.3.4 病理学检查CLP后20 h取肝、肺组织经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色后普通光学显微镜下观察。

表1 小鼠CLP后败血症严重程度评分标准

1.3.5 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）采用 ELISA 测定血浆 TNF-α、IL-1β的浓度。于CLP术后1、2、4和6 h处死动物，摘眼球取血，经离心后获得血浆。TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒购自武汉博士德生物公司。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。使用CurveExpert 1.3软件绘制标准曲线并计算出待测样品浓度值，以pg/ml表示。每个待测样品及标准品均作复孔。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，方差分析的两两比较用SNK-q检验，用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率比较用Log-rank χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存率比较

实验观察7 d对照组15只小鼠无一例死亡；CLP组20只小鼠术后24、36和48 h分别存活8、5和4只，生存率分别为40.0%、25.0%和20.0%；烟碱400μg/kg组30只小鼠术后24、36和48 h分别存活24、19和17只，生存率分别为80.0%、63.3%和56.7%。烟碱400μg/kg组与CLP组的生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.599，P=0.003），烟碱400μg/kg组生存率高于CLP组（P＜0.05）。见图1。

图1 3组小鼠生存率曲线

2.2 肺湿干重比

对照组、CLP组、烟碱400μg/kg组小鼠肺湿干重比分别为（2.71±1.58）、（5.10±0.39）和（2.30±1.03），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=25.867，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，CLP组20 h肺湿干重比高于对照组（P＜0.05）；烟碱400μg/kg组20 h肺湿干重比低于CLP组（P＜0.05）。

2.3 败血症严重程度评分

对照组、CLP组、烟碱400μg/kg组小鼠败血症严重程度评分分别为（6.47±0.74）、（21.00±2.37）和（15.00±3.58）分，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=28.760，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，烟碱400μg/kg组20 h败血症严重程度评分低于 CLP 组（P＜0.05）。

2.4 病理学变化

2.4.1 肝组织对照组肝细胞结构完整，肝小叶形态正常，肝血窦无扩张和炎症细胞浸润。CLP组肝细胞浊肿、脂肪变性，可见灶性坏死，中性粒细胞浸润明显（见图2A）。烟碱400μg/kg组肝细胞未见明显浊肿，有轻度脂肪变性，未见有坏死灶。中性粒细胞浸润程度较轻（见图2B）。

2.4.2 肺组织对照组肺泡上皮细胞形态正常，肺间隔未见增宽，毛细血管无充血和淤血，肺间质未见出血、水肿及炎症细胞浸润，肺泡大小均匀，结构完整。CLP组肺泡结构改变，间隔疏松增宽，肺泡内毛细血管明显充血，可见微血栓形成，肺间质水肿，炎症细胞浸润明显（见图3A）。烟碱400μg/kg组肺泡结构改变不明显，未见毛细血管充血，肺间质轻度水肿，炎症细胞浸润较轻（见图3B）。

图2 两组肝组织病理结果 （HE×200）

图3 两组肺组织病理结果 （HE×200）

2.5 血浆TNF-α浓度

术后1、2、4和6 h对照组、CLP组，以及烟碱400、200和40μg/kg组血浆TNF-α浓度比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血浆TNF-α浓度有差别（F=41.439，P=0.000）。②5组血浆TNF-α浓度有差别（F=79.356，P=0.000）。术后2、4和6 h时，CLP组较对照组血浆TNF-α浓度升高（P＜0.05），烟碱400、200和 40μg/kg组较CLP组血浆TNF-α浓度降低（P＜0.05）；6 h时烟碱400μg/kg组较200μg/kg组TNF-α浓度降低（P＜0.05）；2和6 h时，烟碱400μg/kg组较40μg/kg组血浆TNF-α浓度降低（P＜0.05）；2和4 h时，烟碱200μg/kg较40μg/kg组血浆TNF-α浓度降低（P＜0.05）。③5组间血浆TNF-α浓度变化趋势有差异（F=44.172，P=0.000）。见表2和图4。

表2 各组小鼠不同时间点血浆TNF-α浓度比较 （n =24，pg/ml，±s）

表2 各组小鼠不同时间点血浆TNF-α浓度比较 （n =24，pg/ml，±s）

组别 1 h 2 h 4 h 6 h对照组 242.06±9.64 260.02±19.75 245.74±12.60 256.53±14.82 CLP 组 248.89±10.76 435.26±20.91 869.76±24.61 731.11±42.56烟碱 400μg/kg 组 252.66±11.61 351.24±25.63 680.94±29.09 531.79±8.14烟碱 200μg/kg组 237.90±10.49 360.77±31.96 646.80±18.78 561.63±20.53烟碱 40μg/kg组 236.75±14.44 389.13±11.21 709.53±50.33 589.54±24.27

2.6 血浆IL-1β浓度

术后1、2、4和6 h对照组、CLP组，以及烟碱400、200和40μg/kg组血浆IL-1β浓度比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的血浆IL-1β浓度有差别（F=53.692，P=0.000）。②5组血浆IL-1β浓度有差别（F=78.062，P=0.000）。术后1、2、4和6 h时，CLP组较对照组血浆TNF-α浓度升高（P＜0.05）；术后1、2、4和6 h时，烟碱400μg/kg组较CLP组血浆TNF-α浓度降低（P＜0.05）；术后 1、4和 6 h时，烟碱 200μg/kg组较 CLP组血浆 TNF-α 浓度降低（P＜0.05）；术后1和6 h时，烟碱40μg/kg组较CLP组血浆 TNF-α 浓 度 降 低（P＜0.05）；4 h时 烟 碱400μg/kg组较200μg/kg组血浆TNF-α浓度降低（P＜0.05）；2和 6 h时，烟碱 400μg/kg组较40μg/kg组血浆 TNF-α 浓度降低（P＜0.05）；4 h时，烟碱200μg/kg较40μg/kg组血浆TNF-α浓度降低（P＜0.05）。③5组间血浆TNF-α浓度变化趋势有差异（F=11.758，P=0.000）。见表3和图5。

图4 各组小鼠不同时间点血浆TNF-α浓度变化趋势

表3 各组小鼠不同时间点血浆IL-1β浓度比较 （n =24，pg/ml，±s）

表3 各组小鼠不同时间点血浆IL-1β浓度比较 （n =24，pg/ml，±s）

组别 1 h 2 h 4 h 6 h对照组 267.34±27.10 261.23±29.13 221.95±30.45 245.19±35.03 CLP 组 327.63±21.27 337.63±19.50 456.17±7.08 556.12±7.08烟碱 400μg/kg 组 272.60±13.94 305.99±14.44 384.75±20.81 245.19±35.03烟碱 200μg/kg组 278.75±12.86 311.68±4.22 421.27±15.64 263.93±17.11烟碱 40μg/kg组 290.06±5.23 314.66±6.27 432.92±16.67 254.92±16.36

图5 各组小鼠不同时间点血浆IL-1β浓度变化趋势

3 讨论

神经-免疫调节通路在针对机体感染、创伤或缺血、缺氧等损害性刺激，而产生保护性防御反应方面，起非常重要的作用。中枢神经系统通过激活传出迷走神经纤维，释放神经递质乙酰胆碱，与各种免疫细胞上的α7AchR结合，抑制炎症细胞因子的合成，增加抗炎症细胞因子的合成，调节外周炎症反应，从而维持免疫稳定。

体外培养的人巨噬细胞中加入乙酰胆碱，能够明显抑制TNF-α的合成，并且电刺激小鼠迷走神经能减轻内毒素血症时全身性炎症反应。已知外周血单核细胞上存在的M和N 2种乙酰胆碱受体中，N受体与乙酰胆碱结合后，可抑制TNF-α的合成，即胆碱能抗炎通路主要是通过N受体的激活来实现[6]。共聚焦显微镜技术和逆转录PCR发现，胆碱能神经系统与天然免疫系统密切联系的分子基础在于巨噬细胞等免疫细胞上的N型α-银环蛇毒素敏感的乙酰胆碱受体（α7亚基）。把人巨噬细胞暴露于烟碱或乙酰胆碱后，可抑制TNF-α、IL-1和IL-18的释放。迷走神经的感觉神经元上存在IL-1受体，IL-1与其结合后，刺激传出迷走神经释放乙酰胆碱，乙酰胆碱与巨噬细胞上的α7亚基结合，从而抑制炎症细胞因子产生[7]。

学者通过对胆碱能抗炎通路结构基础的研究，陆续发现激活该通路的各种手段或物质。在经左冠状动脉前降支结扎-开放法复制的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型上，笔者观察到应用烟碱可减轻心肌细胞损伤，减少缺血面积，保护心肌组织。其机制在于烟碱激活胆碱能抗炎通路，降低体内炎症细胞因子水平[8]。

烟碱激活胆碱能抗炎通路对感染性休克保护作用的研究较少。已证实刺激内毒素休克大鼠传出迷走神经，可以减缓低血压性休克的发生时相，阻止血压进行性下降，增加体内抗炎症细胞因子的释放，降低主要脏器组织和血浆中TNF-α含量。若迷走神经切断则明显加重TNF-α对炎症刺激的反应，使动物对内毒素的致死效应更加敏感。CLP法更接近于临床上急性肠穿孔或弥漫性腹膜炎所导致的败血症/感染性休克的病理生理过程。本实验前期采用CLP法复制败血症动物模型，观察到腹腔感染败血症小鼠肝、肺组织病理损伤严重[9]。本研究探讨烟碱对CLP败血症动物生存率、一般状况、败血症严重程度、重要脏器组织病理学的影响，证实烟碱能提高腹腔感染败血症小鼠的存活率，延长其生存时间，降低败血症严重程度的评分，减轻组织器官的病理损害。因此，烟碱对败血症动物具有保护作用。

本研究结果进一步表明，败血症小鼠血浆中TNF-α和IL-1浓度升高，肝、肺组织炎症病理改变明显。而给予烟碱后，血浆中TNF-α和IL-1含量降低，肝、肺组织炎症病理改变减轻，表明烟碱可减轻败血症时的全身性炎症反应，并具有保护肝、肺功能的作用。其机制可能是烟碱激活迷走神经后，释放大量乙酰胆碱，与存在于肝Kupffer细胞、单核细胞上的乙酰胆碱受体α7亚基结合，通过一系列途径阻止Kupffer细胞和单核细胞释放TNF-α和IL-1，从而拮抗肝脏组织乃至全身性的炎症反应，与ZABRODSKII等[10]的研究结果一致。

因此，烟碱对败血症动物保护作用的机制在于抑制炎症细胞因子TNF-α和IL-1的释放，即烟碱具有抗炎效应。并且，这种保护作用及其拮抗炎症介质的效应，可能与其剂量有一定的相关性。

胆碱能性抗炎通路的发现，使烟碱这一存在于烟草中，长期以来一直被人们认为有毒的物质得以重新评价。适量应用烟碱可能有助于临床上积极防治败血症/感染性休克。未来应当进一步研究烟碱对调控炎症介质的上游信号分子，如核因子-кB、Toll样受体等的影响，从分子水平上阐述受体与药物分子相互作用的机制，开发出激活胆碱能抗炎通路，特别是针对α7AchR的新药。

参 考 文 献：

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