变应性鼻炎患者血液嗜酸性粒细胞富集群中TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的变化及其相关性

张晓文，张慧云,2，王 维，湛萌萌，何韶衡

(1. 锦州医科大学附属第一医院，变态反应与临床免疫研究中心，辽宁锦州 121001；2. 苏州市相城人民医院中心实验室，江苏苏州 215100)

变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是由过敏原引起的鼻部炎症性疾病[1]，主要症状是鼻塞、鼻腔分泌物增多、鼻腔瘙痒。目前认为遗传和环境如过敏原均参与AR发病[2]。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是表达于不同细胞的模式识别受体家族，在过敏性疾病中起重要作用[3]。病原微生物及其产物和内源性刺激均可通过TLR依赖途径激活靶细胞，引起或加重过敏反应[4]。

TLR2在识别革兰氏阴性细菌中起重要作用，最近的研究发现过敏患者TLR2 mRNA水平升高[5]，提示TLR2可能参与过敏反应。TLR4可识别脂多糖(LPS)，TLR4激活后可产生针对入侵病原微生物免疫应答。研究报道，过敏性哮喘和AR患者TLR4表达升高[6]，提示TLR4可能参与气道炎症性疾病。呼吸道的炎症细胞如嗜酸性粒细胞和结构细胞均表达TLR7。动物模型实验证明TLR7激动剂可控制过敏性哮喘[7]，TLR9大量表达于AR患者鼻黏膜上皮细胞和骨髓白细胞[8]，提示TLR7和TLR9可能参与过敏性气道炎症。

嗜酸性粒细胞参与AR等气道过敏性疾病[9]。然而，目前人们对AR患者血液嗜酸性粒细胞TLRs的表达，尤其是过敏原对嗜酸性粒细胞上TLRs表达的影响还知之甚少。本研究旨在用流式细胞仪技术检测TLR2、TLR4、TLR7和TLR9在AR患者嗜酸性粒细胞群中的表达情况，并分析其相关性，以期为AR的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1实验试剂购自Biolegend(San Diego, CA, USA)的试剂：APC/Cy7耦合的小鼠抗人CCR3、APC耦合的鼠抗人TLR4、APC耦合的小鼠IgG1、BV421耦合的小鼠IgG1、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死细胞去除染料)、FcR阻断剂、红细胞裂解液；购自R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)的试剂：PE耦合的小鼠抗人TLR7、PE耦合的小鼠IgG2A；购自Santa Cruz(Delaware Ave Santa Cruz, CA, USA)的试剂：FITC耦合小鼠抗人TLR9、FITC耦合的小鼠 IgG2A；购自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)公司的试剂：BV421耦合的小鼠抗人TLR2。蒿草花粉过敏原提取液、尘螨提取液和梧桐花粉过敏原提取液购自北京新华联协和药业有限责任公司(中国)；PBS缓冲液购自Solarbio(北京，中国)；Cytofix/CytopermTM固定/透膜试剂盒购自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)；皮肤点刺试验过敏原购自ALK-ABELLO(Denmark)；其他常用的化学试剂如盐和缓冲液均为分析级纯度。低温高速离心机(Thermo Scientific, USA)，水浴锅(精宏，中国)，FACSVerse流式细胞仪(BD Biosciences, USA)。

1.2研究对象共募集了40位志愿者，其中24例AR患者(AR病例组)和16例健康人(正常对照组)，其一般资料见表1，组间在年龄、性别构成上差异均无统计学意义。本实验AR的诊断标准符合2015年美国耳鼻咽喉头颈外科学会专家组发布的AR临床实践指南[10]；所有AR患者均处于急性发作期，且至少2周前停止服用抗鼻炎治疗的药物，所有志愿者至少1月内未发生过呼吸道感染。本临床研究获得了锦州医科大学附属第一医院伦理委员会的批准，并与每位志愿者均签订了知情同意书。

表1 志愿者的一般资料Tab.1 General information of the volunteers

1.3血液样本的采集对募集的AR急性发作期入院患者和门诊正常人的志愿者分别采集病史资料；均进行皮肤点刺试验，点刺试验阳性的AR患者和点刺试验阴性的正常人为本研究的研究对象，即AR病例组和正常对照组。每位志愿者均采集1 mL外周静脉血于含EDTA抗凝剂的采血管中。

1.4流式细胞术检测血液嗜酸性粒细胞富集群TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的表达全血在无菌环境下分别加入尘螨、蒿草花粉和梧桐花粉过敏原提取液(质量浓度为1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震荡孵育1 h；1 200 r/min 离心6 min后弃去上清，加入死细胞去除染料和FcR阻断剂，均匀混合后，避光孵育15 min，然后加入抗CCR3、TLR2和TLR4抗体，避光孵育15 min后加入红细胞裂解液，避光孵育12 min，离心弃上清后加入1 mL的PBS，1 200 r/min离心6 min，弃上清，用固定/透膜液固定细胞，透膜洗液清洗后加入抗TLR7和TLR9抗体孵育，再用PBS清洗，最后用流式细胞仪检测TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的表达。

1.5统计学处理使用SPSS 13.0软件分析数据，多组间比较采用秩和检验，组间差距有统计学意义时用Mann-WhitneyU进一步做比较。相关性分析采用Pearson相关，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1蒿草花粉过敏原诱导AR嗜酸性粒细胞富集群TLR2+细胞比例升高流式细胞术检测嗜酸性粒细胞富集群(设门方法见图1)中TLR2的表达变化，结果显示，AR患者血液经蒿草花粉刺激后，嗜酸性粒细胞富集群中TLR2+细胞的比例升高了约7%(P<0.05)，梧桐花粉和尘螨过敏原提取液对TLR2的表达影响差异无统计学意义(图2)。3种过敏原对正常对照组TLR2表达影响无统计学意义；对AR病例组患者静息状态下嗜酸性粒细胞富集群TLR2+细胞比例与正常对照组比较差异无统计学意义。

图1 嗜酸性粒细胞富集群的设门方法Fig.1 Gating strategies for eosinophil-enriched cells

2.2AR患者嗜酸性粒细胞富集群中TLR4表达增强流式细胞术检测AR患者组和正常对照组外周血的嗜酸性粒细胞富集群中TLR4(图3A、B)的表达，结果显示，AR患者嗜酸性粒细胞富集群中TLR4+细胞的MFI与健康对照组相比升高20%(P<0.05)。梧桐花粉、蒿草花粉和尘螨过敏原提取液对健康人和AR患者血液嗜酸性粒细胞TLR4表达影响很小(P>0.05)。

图3 人外周血嗜酸性粒细胞富集群中TLR4细胞MFI的流式细胞仪检测结果(A)及表达变化分析(B)Fig.3 Representative flow cytometric graphs (A) of MFI of TLR4 in eosinophil-enriched cells from human blood and expressions by MFI analysis (B)

2.3AR患者嗜酸性粒细胞富集群中TLR7+细胞比例增多用流式细胞术检测AR患者和正常人群血液嗜酸性粒细胞富集群TLR7+和TLR9+的细胞比例，结果显示，与健康人相比，AR患者嗜酸性粒细胞富集群中TLR7+细胞的比例升高4.8倍(图4A、B)，TLR7+嗜酸性粒细胞的MFI升高46%(图4C、D，P<0.05)；而TLR9在正常人和AR患者血液嗜酸性粒细胞的表达差异无统计学意义。

图4 人外周血嗜酸性粒细胞富集群中TLR7+细胞表达的流式细胞仪检测结果(A)和百分比分析(B)、MFI代表图(C)及表达变化的比较(D)Fig.4 Representative flow cytometric graphs (A) of TLR7+ expression in eosinophil-enriched cells from human blood and percentage analysis (B), MFI of TLR7 (C) and MFI analysis of the expression (D)

2.4嗜酸性粒细胞群TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的表达中度相关静息状态下，AR患者嗜酸性粒细胞富集群中TLR2和TLR7表达增强，蒿草花粉过敏原诱导嗜酸性粒细胞富集群TLR2表达升高，提示TLR2、TLR4、TLR7和TLR9之间有潜在关系。进一步对其细胞表达水平进行了相关性分析，Pearson检验结果显示(表2)，AR患者嗜酸性粒细胞群中TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的嗜酸性粒细胞均呈中度相关(Pearson相关系数分别为r=-0.670，P<0.01；r=-0.430，P<0.05；r=0.446，P<0.05)。

表2 AR患者TLR2+、TLR4+、TLR7+和TLR9+嗜酸性粒细胞的相关性Tab.2 Correlations between TLR2+, TLR4+ ,TLR7+ and TLR9+ eosinophils

3 讨 论

螨虫和植物花粉如艾蒿花粉、梧桐花粉是室内、外过敏原的重要来源，通过与过敏反应效应细胞如嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE-FcεRI复合物发生反应可诱导AR等过敏性疾病的发生[11-12]。近年来的研究发现参与各种抗原免疫应答的TLR也可诱导AR发病[13-14]。

TLR2配体可以抑制肥大细胞脱颗粒[15]，提示TLR2可能有抑制过敏反应的作用。本研究结果发现AR患者静息状态下嗜酸性粒细胞富集群TLR2+细胞的比例降低，提示进一步证实TLR2可抑制AR发病；而经蒿草花粉过敏原刺激后，AR患者血液嗜酸性粒细胞富集群中TLR2升高约7%，提示过敏原中的某种蛋白成分可能诱导嗜酸性粒细胞表达TLR2，但其具体机制尚需进一步研究。研究发现TLR4在AR患者中表达水平升高[6]，提示TLR4可能参与AR。本研究发现AR患者嗜酸性粒细胞富集群中TLR4+细胞的MFI升高20%(P<0.05)，进一步提示TLR4参与AR发病。

有报道称TLR7激活嗜酸性粒细胞与患者的过敏状态有关[16]。此外，研究发现TLR7广泛参与气道过敏性疾病[7,16-18]。本研究发现，AR患者静息状态下嗜酸性粒细胞富集群中TLR7+细胞的比例升高4.8倍。由于TLR7激动剂可控制过敏性哮喘[7]，本研究结果提示AR可能通过反馈机制诱导嗜酸性粒细胞表达TLR7，AR发病可能与其他细胞TLR7表达减少有关。此外，本研究未发现AR患者和健康人血液嗜酸性粒细胞TLR9的差异性表达，但并不排除其他细胞通过TLR9影响过敏性炎症发生的可能。

TLRs通过与其配体相互作用，激活免疫细胞和结构细胞而发挥天然免疫和适应性免疫应答。TLRs(TLR3除外)与其配体交联可诱导MyD88募集至TLRs上的TIR结构域[19-20]，提示TLRs之间可能存在某种联系。本研究发现AR患者嗜酸性粒细胞群中TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的嗜酸性粒细胞均呈中度相关，提示TLRs可能通过诱导其他TLRs的表达而参与AR。总之，嗜酸性粒细胞源的TLR2、TLR4和TLR7可能在AR中起重要作用，TLR2、TLR4和TLR7可能是治疗AR的潜在靶点。

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