染色体8q拷贝数变异与肝细胞癌患者术后总生存期的相关性及其靶基因筛选

赵昆，徐菊英，许青，，朱忠政

本研究创新点：

（1）本研究首次发现染色体8q24.13-24.3增益是肝细胞癌（HCC）患者术后总生存期（OS）的影响因素，有助于在HCC诊断早期对HCC患者的预后进行判断，为早期临床干预和个体化治疗提供依据。（2）染色体8q24.13-24.3增益片段内ATAD2、PVT1、NDRG1呈拷贝数依赖性表达上调，可能参与了HCC不良预后的演进过程，为可能的分子靶向治疗提供了潜在靶点。

我国肝细胞癌（HCC）的死亡率为422.1/10万，占所有恶性肿瘤的第三位［1］。尽管目前手术、放疗、化疗和分子靶向治疗有所进展，但HCC患者的预后仍然很差。目前尚缺乏在诊断初期对HCC患者的预后进行预测的可靠的预后评估体系，因此筛选可以预测HCC预后的分子标志物具有重要意义［2］。拷贝数变异（CNA）即基因组DNA的片段性增益和丢失，与多种肿瘤的发生发展密切相关，可作为筛选预测HCC预后的标志物的有效途径［3-4］。既往研究报道，染色体8q增益与口腔癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤等肿瘤的不良预后相关［5-9］，并且与HCC的临床病理学特征如肿瘤直径大、分化差、分期高相关［10-12］，但有关染色体8q增益与HCC预后的关系目前仍不清楚。为此，本研究探讨染色体8q CNA与HCC患者术后总生存期（OS）的相关性并筛选预后相关潜在靶基因，以期在诊断初期对HCC患者的预后进行判断，从而对预后不良患者进行特殊干预和个体化治疗。

1 对象与方法

1.1 纳入与排除标准 纳入标准：行根治性切除术，病理证实为HCC；术前未行放化疗。排除标准：病理证实伴肝内胆管癌成分、癌组织中癌细胞占比＜80%或癌旁肝组织过少。

1.2 研究对象 收集2007—2008年于第二军医大学附属东方肝胆外科医院手术住院的HCC患者187例为研究对象。其中男148例，女39例；年龄19～79岁，平均年龄（51.3±12.8）岁。收集所有患者癌组织，标本离体30 min内液氮冷冻，-80 ℃保存备用。本研究经第二军医大学附属东方肝胆外科医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.3 一般资料收集 记录患者性别、年龄、术后甲胎蛋白（AFP）水平、肝功能Child-Pugh分级、肝硬化情况、糖尿病史、Edmondson-Steiner分级、有无完整肿瘤包膜、TNM分期。

1.4 染色体8q CNA检测与数据处理 采用Qiagen抽提纯化试剂盒（Qiagen公司）提取癌组织基因组DNA。采用Agilent 244K（Hu-244A，Agilent公司）微阵列比较基因组杂交（aCGH）技术检测染色体8q CNA。该平台在染色体8q共包含7 487个寡核苷酸探针，DNA分辨率高达13.23 kb。采用Agilent G2565BA微阵列扫描仪对芯片进行扫描，采用Feature Extraction 9.5进行数据提取。利用R统计学软件包DNAcopy对全部样本进行基于探针log2比值比（癌组织与正常组织DNA拷贝数比值的log2对数）的染色体8q片段循环二元分割，每一分割片段的log2比值比被赋予该片段内所有探针log2比值比的平均值。只有5个或5个以上的连续探针发生同向变异才能定义为一个变异片段。片段log2比值比＞0.5定义为CNA增益；片段log2比值比为-0.5～0.5定义为CNA稳定（即CNA无增益/丢失）；片段log2比值比＜-0.5定义为CNA丢失。依据UCSC公共数据库（http：//genome.ucsc.edu，NCBI35/hgl7）定位探针序列和基因。

1.5 染色体8q24.13-24.3片段内50个已知基因mRNA表达水平检测与数据处理 采用TRIZOL一步法（Invitrogen公司）提取癌组织总RNA。分别采用QIAGEN RNAeasy kit和QIAGEN Oligotex Direct mRNA kit（Qiagen公司）进行总RNA纯化和Poly（A）+mRNA提取。采用Affymetrix U133 Plus 2.0寡核苷酸基因芯片（Affymetrix公司）检测染色体8q24.13-24.3片段内50个已知基因mRNA表达水平。采用Gene array Scanner 3000 7G激光共聚焦扫描系统（Affymetfix公司）对杂交后芯片进行信号扫描，利用GCOS 1.4软件读取数据。数据预处理及归一化采用R统计学软件包affy中的GCRMA法。基因mRNA表达水平以log2比值比表示。

1.6 随访 术后采用病历结合电话随访方式进行随访，每1～6个月随访1次，末次随访时间为2016-12-31。随访时间2.6～108.6个月，中位随访时间45.0个月。最终共66例患者完成随访，其中52例因HCC死亡。OS定义为手术至因HCC死亡或末次随访时的时间间隔。

1.7 统计学方法 采用Stata 13.0软件进行统计分析。计量资料以（）表示，计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；一般资料、染色体8q内各高频CNA（增益发生率＞20%）片段与OS的相关性分析采用Log-rank检验；采用Cox比例风险回归模型分析OS的影响因素；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，其比较采用Log-rank检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。CNA增益HCC患者和CNA无增益HCC患者基因mRNA表达水平比较采用Mann-Whitney U检验，以P＜0.000 1为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者一般资料与OS的相关性 HCC患者性别、年龄、术后AFP水平、肝功能Child-Pugh分级、肝硬化情况、Edmondson-Steiner分级与OS均无相关性（P＞0.05）；HCC患者糖尿病史、有无完整肿瘤包膜、TNM分期与OS有相关性（P＜0.05，见表1）。

2.2 染色体8q内各高频CNA片段与OS的相关性 完成随访的66例患者中，染色体8q全臂或部分增益22例（33.3%）。染色体8q片段循环二元分割结果显示，高频CNA片段共5个，分别定位于为染色体8q13.3-21.3、染色体8q21.3-23.3、染色体8q23.3-24.13、染色体8q24.13-24.3和染色体8q24.3（见表2）。

以OS为因变量（连续性变量），分别以染色体8q13.3-21.3、染色体8q21.3-23.3、染色体8q23.3-24.13、染色体8q24.13-24.3和染色体8q24.3为自变量（赋值：无增益=0，增益=1），进行单因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示，染色体8q24.13-24.3增益与OS有相关性（P＜0.05，见表2）。

表1 HCC患者一般资料与OS的相关性Table 1 Association of general clinicopathological factors with overall survival

以OS为因变量（连续性变量），以染色体8q24.13-24.3（赋值：无增益=0，增益=1）、性别（赋值：女=0，男=1）、年龄（赋值：≤50岁=0，＞50岁=1）、术后AFP水平（赋值：≤20 μg/L=0，＞20 μg/L=1）、肝功能Child-Pugh分级（赋值：A级=0，B级=1）、肝硬化情况（赋值：无=0，有=1）、有无糖尿病史（赋值：无=0，有=1）、Edmondson-Steiner分级（赋值：Ⅱ级=0，Ⅲ级=1）、有无完整肿瘤包膜（赋值：无=0，有=1）、TNM分期（赋值：Ⅰ/Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）为自变量，进行多因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示，染色体8q24.13-24.3增益、有无糖尿病史、有无完整肿瘤包膜、TNM分期是OS的影响因素（P＜0.05，见表3）。

生存分析结果显示，染色体8q24.13-24.3增益HCC患者生存率低于染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者（χ2=6.56，P=0.010，见图1）。

2.3 染色体8q24.13-24.3增益片段内的差异表达基因

为进一步探讨染色体8q24.13-24.3增益片段内与OS相关的潜在靶基因，本研究组针对具有配对aCGH和mRNA表达数据的109例患者，比较染色体8q24.13-24.3增益HCC患者（n=29）与染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者（n=80）染色体8q24.13-24.3片段内50个已知基因mRNA表达水平的差异，结果显示，染色体 8q24.13-24.3增益 HCC患者 C8orf76、ATAD2、WDYHV1、FBXO32、TMEM65、TATDN1、ZNF572、SQLE、KIAA0196、NSMCE2、PVT1、FAM49B、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KHDRBS3、EIF2C2 mRNA 表达水平高于染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者，差异有统计学意义（P＜0.000 1）；染色体8q24.13-24.3增益HCC患者与染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者 FAM83A、TRIB1、PHF20L1、ST3GAL1、PTK2、NDUFB9、TRMT12、FAM91A1、GPR20、COL22A1、MTSS1、TSNARE1、EFR3A、SLC45A4、TG、GSDMC、ZHX1、TMEM71、MYC、ANXA13、FAM135B、HHLA1、WISP1、KCNK9、RNF139、LRRC6、DENND3、CCDC26、CHRAC1、NCRNA00051、TRAPPC9、FAM84B、KCNQ3 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.000 1，见表4）。

表2 染色体8q高频CNA片段及其与HCC患者术后OS的相关性Table 2 Association of high-frequency CNA（s） in chromosome 8q with overall survival in patients with hepatocellular carcinoma

表3 HCC患者术后OS影响因素的多因素Cox比例风险回归模型分析Table 3 Multiple Cox regression analysis of the associated factors for overall survival in patients with hepatocellular carcinoma

图1 染色体8q24.13-24.3增益HCC患者与染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者生存曲线分析Figure 1 Survival curve of hepatocellular carcinoma patients with 8q24.13-24.3 gain and those without

3 讨论

近年来有关染色体CNA与肿瘤预后的相关性研究备受关注。染色体8q增益作为恶性肿瘤常见分子事件，与多种肿瘤预后相关，但其与HCC预后的相关性尚不清楚。为此，本研究探讨染色体8q CNA与HCC患者术后OS的相关性并筛选预后相关潜在靶基因，以期在诊断初期对HCC患者的预后进行判断，从而对预后不良患者进行特殊干预和个体化治疗。

染色体8q增益频繁发生于包括HCC在内的多种恶性肿瘤，且与HCC肿瘤大、分化差、分期高相关［10-12］。本研究单因素Cox比例风险回归模型分析结果显示，染色体8q24.13-24.3增益与OS有相关性。既往研究报道，染色体8q增益与口腔癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、葡萄膜黑色素瘤等患者的不良预后相关［5-9］。这些研究结果共同提示，染色体8q增益可能是多种肿瘤的不良预后因素，因此其与其他肿瘤的预后关系值得进一步研究。VINCENT-CHONG等［5］报道口腔癌不良预后相关的染色体8q增益片段定位于染色体8q22.3-23.1；HAMMOND等［9］报道葡萄膜黑色素瘤不良预后相关的染色体8q增益最小关键区域定位于染色体8q22.1-8qter；而本研究多因素Cox比例风险回归模型分析结果显示，染色体8q24.13-24.3增益是OS的影响因素。以上结果共同提示，不良预后相关的染色体8q增益最小关键区域具有肿瘤类型特异性，可能反映了不同类型肿瘤在预后相关基因谱的差异。一项关于乳腺癌的研究显示，染色体8q增益与以紫杉醇为基础的新辅助化疗耐药有关［13］。未来需进一步研究验证在染色体8q24.13-24.3增益HCC患者中是否存在同样的化疗耐药性及其影响HCC患者OS的程度。

肿瘤DNA片段性增益的生物学效应主要是通过片段内重要肿瘤相关基因的拷贝数依赖性表达上调实现的。本研究结果显示，染色体8q24.13-24.3增益HCC 患 者 C8orf76、ATAD2、WDYHV1、FBXO32、TMEM65、TATDN1、ZNF572、SQLE、KIAA0196、NSMCE2、PVT1、FAM49B、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KHDRBS3、EIF2C2 mRNA表达水平高于染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者，提示其中某（些）基因可能驱动了染色体8q24.13-24.3的增益，并在HCC患者不良预后中发挥重要作用。ATAD2作为染色体8q24片段增益的驱动基因，其编码的ATAD2蛋白在细胞生长、分化和凋亡等多种细胞生物学过程中发挥重要作用，且ATAD2蛋白过表达与HCC的不良预后相关［14-15］。PVT1是一种长链非编码RNA，其通过调节细胞增殖、转移、细胞周期、细胞凋亡和耐药性来促进肿瘤的发生发展［16］，其过表达与包括HCC在内的多种肿瘤不良预后相关［17-21］。NDRG1基因编码的NDRG1蛋白属于α/β水解酶超家族成员，其过表达更常见于侵袭性、转移性高且生存率低的HCC患者中［22-23］。目前尚缺乏其他基因相关研究，笔者推测针对这些基因进行相关功能学研究将有助于理解基因上调与染色体8q24.13-24.3增益的因果关系及其在HCC患者预后中的作用。

表4 染色体8q24.13-24.3增益HCC患者与染色体8q24.13-24.3无增益HCC患者染色体8q24.13-24.3片段内50个已知基因mRNA表达水平比较Table 4 Comparison of the mRNA expression level of 50 known genes in chromosome 8q24.13-24.3 segment between hepatocellular carcinoma patients with 8q24.13-24.3 gain and those without

本研究存在以下局限性。首先，本研究中HCC患者的样本量相对较小，尤其是染色体8q CNA与OS的相关性分析仅涉及66例患者，未来需进一步在更大样本量的基础上进行验证性研究。其次，虽然既往一些研究已表明，Affymetrix阵列分析结果与定量PCR分析结果具有一致性［24-25］，但本研究Affymetrix阵列分析检测出的表达上调基因未经其他方法验证。最后，被筛选出的差异表达基因未进行体内外功能学实验研究。

综上所述，染色体8q24.13-24.3增益与HCC患者OS有关，可作为HCC的一个预后预测因子。ATAD2、PVT1、NDRG1拷贝数依赖性表达上调可能参与了HCC不良预后的发生发展过程。

志谢：感谢第二军医大学附属东方肝胆外科医院病理科董辉主治医师在样本收集和术后生存随访中给予的帮助。

作者贡献：赵昆进行文章的构思与设计、数据收集，撰写论文；徐菊英进行数据整理、统计学处理；朱忠政进行研究的实施与可行性分析、论文的修订，负责文章的质量控制及审校；许青对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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