龙眼肉不同提取物的神经保护作用及其机制

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

龙眼肉为无患子科植物龙眼DimocarpuslonganLour. 的假种皮，属药食同源类中药，具有补益心脾，养血安神之功效；临床用于气血不足，健忘失眠等症[1]。现代研究表明，龙眼肉具有改善记忆[2]、抗焦虑[3]、抗氧化[4-5]等多种作用，据报道，氧化应激很可能是记忆减退、焦虑证等的一个共同诱因[6-7]。PC12 细胞来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，因其具有许多神经元特性，被广泛用于老年痴呆、焦虑证等神经系统疾病的体外研究[8]。基于龙眼肉的上述作用，作者推测，龙眼肉很可能具有神经细胞保护作用；课题组前期研究也表明，龙眼肉提取物能够促进PC12细胞增殖并抑制其凋亡[9]，但对不同提取物的神经保护作用及其机制的比较研究前期未做报道。本研究通过比较龙眼肉不同提取物对细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响，探讨龙眼肉不同提取物的神经保护作用，为系统研究龙眼肉神经保护作用的物质基础及机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 龙眼肉，安徽益生源中药饮片科技有限公司(批号160301)；高分化PC12细胞，辽宁中医药大学药理实验室提供；DMEM高糖培养基(批号8116244)，Gibco；胰蛋白酶(批号GP3108)、青链霉素双抗溶液(批号GA3502)、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(批号113688)，Genview；胎牛血清(批号：20160629)，四季青；MTT(批号M8180)，北京Solaibio；Aβ25-35(批号095M4774V)，Sigma；SOD(批号DZE30169)、MDA(批号DZE30157) Elisa试剂盒，南京建成；NU-4750型二氧化碳培养箱，Nuaire；RE-52 旋转蒸发仪，上海亚荣；NIB-100F型倒置荧光显微镜，宁波永新；MR-96A型酶标仪，深圳迈瑞；NoVocyte 451141112066流式细胞仪，艾森生物。

1.2 方法

1.2.1 龙眼肉不同提取物的制备 龙眼肉，用1∶12(m∶v)的去离子水微沸提取1 h，提取3次，合并滤液，按极性大小，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集合并各次滤液，分别得到龙眼肉的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，60 ℃减压浓缩，4 ℃密封保存。

1.2.2 MTT实验及SOD、MDA水平测定 对数生长期的PC12细胞以105/mL密度，接种于96孔板，37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h后，随机分为正常组、模型组和龙眼肉提取物高低剂量组及石杉碱甲组，于加入Aβ前2 h加入；模型组与给药组同步加入Aβ25μM；正常组常规培养。加入Aβ24 h后，吸出各组细胞上清液，采用Elisa试剂盒检测SOD活性及MDA含量；细胞中加入5 mg/mL MTT，继续培养4～6 h，加入100μL DMSO于酶标仪490 nm处测定各孔吸光度(A)值，计算细胞存活率。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 PC12细胞接种于6 cm培养皿中，随机分为正常组，模型组和龙眼肉提取物组。除正常组常规培养外，其余各组采用200 μM H2O2处理细胞8 h，给药组加入H2O2前先加受试药物预处理2 h。经H2O2处理12 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡。每组3个复孔。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计。组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 龙眼肉不同提取物对细胞增殖的影响 MTT法检测结果(图1)表明，细胞存活率模型组较正常组降低(P<0.05)，龙眼肉水提取物0.5、1.0 mg/mL和正丁醇提取物1.0 mg/mL组较模型组提高(P<0.01)；正丁醇提取物0.5 mg/mL、乙酸乙酯提取物和阳性对照石杉碱甲(2 μM)，实验浓度范围内未见神经保护作用(P>0.05)。结果提示，实验浓度范围内，龙眼肉水提取物促进细胞增殖作用最明显。

2.2 龙眼肉不同提取物对SOD、MDA水平的影响 图2A结果表明，SOD活力，模型组较正常组SOD降低(P<0.05)；龙眼肉水和正丁醇提取物组较模型组提高(P<0.05，P<0.01)；乙酸乙酯提取物组与模型组比较无差异但有升高趋势。图2B结果表明，MDA含量模型组较正常组增加但无显著差异；龙眼肉不同提取物对MDA含量亦无明显影响。结果提示，实验浓度下，龙眼肉水提取物抗氧化能力最强。

水、正、乙分别代表水、正丁醇和乙酸乙酯提取物；0.5、1.0代表给药浓度0.5、1.0 mg/mL；石杉代表石杉碱甲 2 μM。

2.3 龙眼肉不同提取物对细胞凋亡的影响

由图3可见，龙眼肉不同提取物均可使受损细胞活细胞数提高(P<0.01，图3B)、早期凋亡细胞减少(P<0.01，P<0.05，图3C)；对晚期凋亡及细胞坏死，仅乙酸乙酯部位有明显作用。

3 讨论

高分化PC12细胞因具有神经内分泌细胞的一般特征，被广泛应用于神经系统疾病研究。Aβ和H2O2均具有细胞毒性，可诱导细胞氧化应激损伤。因Aβ沉积是阿尔茨海默病(AD)的主要病理特征之一，氧化应激又是导致AD的一个重要诱因，故Aβ和H2O2常被用于构建体外AD细胞模型。作者前期采用H2O2诱导PC12细胞损伤，用龙眼肉不同提取物进行干预，结果表明，龙眼肉水、正丁醇及乙酸乙酯提取物对细胞存活均有一定的保护作用，实验浓度范围内，以乙酸乙酯提取物促进细胞增殖作用最明显，并且其对H2O2诱导的细胞凋亡有一定抑制作用[9]。但是，不同提取物对Aβ诱导的体外AD模型是否有保护作用以及不同提取物对H2O2诱导的细胞凋亡的比较研究前期均未报道。本研究采用Aβ和H2O2诱导建立PC12细胞损伤模型，并探讨龙眼肉不同部位的神经保护作用。综合本实验结果并联合前期实验结果，作者推测，龙眼肉不同极性部位均有神经保护作用，但作用机制不完全相同：水和正丁醇提取物主要是提高细胞抗氧化能力，抑制早期细胞凋亡；乙酸乙酯提取物主要是抑制细胞各期凋亡及坏死。

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