TNF-α启动子区单核苷酸多态性与中国维吾尔族白癜风的相关性

王晓朋 吴秀娟 赵宗峰 王 鹏 布瓦杰尔·亚克亚 普雄明 康晓静

白癜风是一种难治性色素脱失性自身免疫性皮肤病，是皮肤黏膜内黑素细胞选择性毁损所致。本病在世界范围内发病率为0.5%～2%[1]，我国人群中发病率约0.5%[2]。近年研究发现，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)启动区基因单核苷酸多态性与白癜风疾病易感性相关[3-5]，且不同人群中TNF-α启动区多态性可能存在不同[6]。本研究为进一步探讨白癜风发病机制中TNF-α基因启动区单核苷酸多态性与中国维吾尔族人群白癜风相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2011-2014年新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科维吾尔族白癜风患者316例，年龄(23.90±14.67)岁，男∶女为4∶5；维吾尔族健康对照组330例，年龄(25.25±11.18)岁，男∶女为3∶2。根据以下特点将白癜风患者分组：发病年龄(早发型：发病年龄≤20岁和迟发型：>20岁)；白癜风分型(局限型、散发型、泛发型、肢端型)；白癜风家族史(有和无)。经知情同意并签字后抽取外周静脉5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，放入-80℃冰箱中保存备用。所有白癜风患者的诊断标准按照中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会颁布的关于白癜风的诊断标准和疾病分期(2010年)[7]由两位皮肤科医生进行诊断，并排除其他可能导致色素减退的疾病如花斑癣、贫血痣、斑驳病、白化病、单纯糠疹、老年性白斑等。健康对照组排除自身免疫性和系统性疾病的白癜风人群，同时要求均无白癜风家族史。本研究通过新疆自治区人民医院医学伦理委员会批准，所有入选者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本采集和基因型DNA提取 用2.5%EDTA抗凝管取肘静脉血1 mL。利用全血基因DNA提取试剂盒(TIANamp 北京鼎国生物技术有限公司合成)提取白癜风患者及健康对照组DNA。所得样本-80℃保存。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 用在线软件primer3 input 设计合适长度488 bp且包含三个目的位点SNP的扩增引物(北京鼎国生物技术有限公司)，上游引物：5’-TCGATGAAGCCCAATAAACC-3’，下游引物：5’-TTTCATTCTGACCCGGAGAC-3’。PCR反应体系：总体积25 μL，包含1 μL引物混合液，2×Tap PCR Green Mix 12.5 μL，2 μL模板，9.5 μL去离子水。取5 μL PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定片段长度，所有PCR产物均合格。PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，60℃退火45 s，72℃ 延伸30 s，72℃再延伸 5 min，35个循环，最后4℃保存。

1.3 基因位点单核苷酸多态性(SNP)检测 应用DNA测序法进行检测。普通PCR扩增目的基因片段产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测合格。扩增产物送至上海生工公司测序，测序仪器为美国ABI3730型DNA 全自动测序仪完成测序并记录结果。

1.4 统计学方法 所有数据采用SSPS 17.0软件包进行分析。白癜风组和健康对照组定量资料计算用均数±标准差，采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律进行检测。卡方检验(χ2)比较不同组别等位基因频率及基因型频率，相对危险度用比值比(OR)以及95%可信区间(95%CI)来评价，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNF-α SNP的基因型及等位基因在两组的分布 各组TNF-α基因三种位点九种基因型及等位基因在维吾尔族白癜风患者和正常对照组的分布，见表1。维吾尔族白癜风和对照组TNF-α rs1799964、TNF-α rs1800630、TNF-α rs1799724-基因型和等位基因比较均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 TNF-α SNP在白癜风组临床表型的分布 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724的基因型、等位基因在维吾尔族白癜风患者临床表型(性别、年龄、分型、家族史)进行分层比较所得χ2值、P值、OR(95%可信区间)分布，见表2、表3。白癜风患者TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型和等位基因频率在性别均无明显差异(P>0.05)。TNF-α rs1799724基因型频率在早发型、局限型及有家族史的患者显著高于迟发型其他三种类型(散发型、泛发型、肢端型)及无家族史的患者，均有统计学意义(均P<0.05)，TNF-α rs1799724等位基因频率在有家族史的患者与无家族史的患者比较显示有显著差异(OR=4.269，95%CI:1.822～9.999)。

表1 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型及等位基因在两组的分布

注：(G)代表基因型，(A)代表等位基因；rs1799964、rs1800630、rs1799724(基因型及等位基因频率在维吾尔族白癜风组与对照组比较，均P>0.05)

表2 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724基因型与维吾尔族白癜风临床表型的分布

表3 TNF-α rs1799964、rs1800630、rs1799724等位基因与维吾尔族白癜风临床表型的分布

3 讨论

细胞因子是一种重要的免疫调节物质，细胞因子网络的不平衡甚至缺陷会引起免疫功能的不同反应，因此，细胞因子网络可能很大程度上决定了自身免疫疾病的易感性与严重性。TNF-α是一种多功能的重要细胞因子，表达于巨噬细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞和角质形成细胞，在预防感染、检测肿瘤和炎症的刺激反应中起广泛的生物学效应。表皮黑素细胞单元由黑素细胞和32个角质形成细胞组成。TNF-α[8]作为角质形成细胞旁分泌细胞因子，可诱导黑素细胞表面ICAM-1和IFN-r的表达和启动细胞凋亡而导致黑素细胞死亡，显著抑制黑素细胞增殖及降低酪氨酸酶活性，但具体通过什么通路和机制有待进一步研究。相关研究显示，TNF-α在寻常型白癜风患者血清、皮损水平显著高于健康人群，且进展期呈现最高值。同时，TNF-α[9]拮抗剂通过抑制黑素细胞特异细胞毒性T细胞对黑素细胞的破坏进而阻止进展期白癜风患者色素进一步脱失，故TNF-α在白癜风发病过程中扮演重要角色。

TNF基因位点位于人类6号染色体上21区3带6p(6p21.31)主要组织相容性复合体(MHC)III类区域内，长约3Kb，包含4个外显子和3个内含子。在TNF基因5’末端调控序列在转录与反转录水平上监管TNF-α的生成，并且TNF-α基因多态性在不同种族中存在差异[10-12]，而这些差异可能导致相关疾病的发病、进展及预后在不同民族存在差异[13,14]。目前研究最多的五个位点：rs361525G/A、rs1800629A/G、rs1799724C/T、rs1800630C/A和rs1799964T/C。TNF-α启动区基因多态性与糖尿病、甲状腺疾病、痤疮、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮等多种疾病易感性相关，但国内TNF-α rs1799724、rs1800630和rs1799964与白癜风相关性的尚未见报道。2006年，对61个土耳其白癜风的研究首次报道TNF-α rs1800629G/A与白癜风患者易感性无明显相关性[4]。而2009年，通过对176个伊朗白癜风患者的研究认为，TNF-α rs1800629G/A在女性白癜风患者与对照组有差异性，在男性白癜风患者与对照亚类之间无差异性[3]。Laddha等[5]研究发现，TNF-α启动区rs361525、rs1800629、rs1799724、rs1800630、rs1799964基因多态性的基因型和等位基因在泛发型或局限型白癜风患者均处于高表达水平与健康对照相比，且rs361525、rs1800629、rs1799724、和rs1799964多态性可提高白癜风患者血清中TNF-α的转录和蛋白水平，而rs1800630-863多态性相反，暗示TNF-α启动子区基因多态性与白癜风易感性相关。有趣的是，本研究发现rs1799724、rs1800630、rs1799964基因多态性的分布在白癜风患者和对照组之间无显著差异；进一步分析rs1799724、rs1800630、rs1799964位点等位基因分布与白癜风患者临床表现相关性表明，rs1799724等位基因T参与有家族史白癜风的发病。

rs1799724位点可与核转录因子-kB结合，该位点碱基的替换可阻碍与p50-p50二聚体的结合，从而减弱核转移因子-kB在增强TNF-α活性的作用[15]。TNF-α的rs1799964位点存在碱基T

本研究通过对TNF-α启动区rs1799724、rs1800630、rs1799964三个SNP进行分型研究，证实TNF-α rs1799724 T等位基因与中国维吾尔族白癜风的相关性，更进一步提示TNF-α在白癜风发病机制中发挥重要作用。但本研究尚有一些不足之处，第一，本研究基于单个基因多态性进行关联研究，在庞大的基因网络中相互非常广泛和复杂，而基因多态性之间是否有交互作用尚未明确，那么这些遗传变异与疾病发病机制的相关性是否会受到其它基因多态性的影响尚不能明确。第二，TNF-α启动区基因多态性在白癜风发生发展过程中发挥的作用及发病机制尚不完全清楚，其与白癜风的可能相关性及作用机制疾病仍待更深入研究。