茶多酚二元醇脂质体的制备及质量评价

宋 娟 于绪东 张振宇 王 栋

茶多酚(Tea-Polyphenol, TP)是茶叶中一类多羟基酚类化合物的总称，约占茶叶干重的30%。其中儿茶素为TP的主要成分，包括表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表儿茶素(EC)[1-4]。研究表明，TP对白癜风、紫外线辐射、过敏、痤疮、保健美容等多种皮肤科疾病有效，在临床皮肤病治疗中具有广泛的应用前景[5-7]。然而，TP结构中的羟基及没食子酸极易在光照、高温、碱性等条件下发生氧化、聚合、缩合等变化，导致其体内外分解快速，稳定性较差，且TP脂溶性弱，皮肤渗透性差的特点，进一步限制了TP在皮肤病治疗中的应用[8-11]。

二元醇脂质体(Binary ethosome)是一种新型的柔性脂质体，是Zhou等[12]基于试验结果对乙醇脂质体改进得到的新型经皮给药载体，采用二元醇相(包括乙醇和丙二醇)代替单纯的乙醇制备的二元醇脂质体，具有生物相容性好、制备工艺简单、性质稳定、皮肤渗透性及滞留性强等特点[13,14]。若将TP制成二元醇脂质体能够有效改善TP稳定性及皮肤渗透性差的缺陷。目前，国内外已有关于TP乙醇脂质体的报道，但尚未见TP二元醇脂质体的相关研究，因此，本文采用乙醇和丙二醇组成的混合醇代替单纯的乙醇首次制备了TP二元醇脂质体(TP-EL)，并对TP-EL的质量进行评价。

1 材料

1.1 仪器 BS110S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；TU-1901型双光束紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；JY92-II 型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；LP 220S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Nano ZS90 粒度仪(英国Malvern 公司)；DF-101S集热式磁力加热搅拌器(中国金坛市医疗仪器厂)。

1.2 试剂 茶多酚(无锡市世纪生物工程有限公司，纯度为98%)；大豆卵磷脂(北京奥博星生物技术有限公司)；乙醇(大连川连酒厂)；胆固醇(广州南方化玻公司)；丙二醇(湖南尔康高科药业有限公司)；酒石酸钾钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、甲醇均为分析纯。

2 方法

2.1 TP-EL的制备 采用乙醇注入法制备TP-EL。称取TP、磷脂及胆固醇置于密闭容器中，加入适量的乙醇和丙二醇(体积比为2∶1)混合溶液溶解，随后置于磁力搅拌器上。在30℃条件下，用注射器将纯化水以缓慢细流状注入至上述溶液中，注完后继续搅拌适当时间，将得到的水性混悬液超声后过0.22 μm滤膜，即得TP-EL。

2.2 单因素考察 以TP-EL的包封率为评价指标，对磷脂的浓度、磷脂与胆固醇的比例、药物与磷脂的比例、制备温度及搅拌时间进行筛选。

2.2.1 磷脂的浓度 按“2.1 TP-EL的制备”项下方法分别制备磷脂浓度为2%，3%，4%及5%的TP-EL，测定TP-EL的包封率，考察磷脂浓度对TP-EL包封率的影响。

2.2.2 磷脂与胆固醇的比例 按“2.1 TP-EL的制备”项下方法分别制备磷脂与胆固醇的质量比为3∶1、5∶1、10∶1、15∶1 的TP-EL，测定TP-EL的包封率，考察磷脂与胆固醇比例对TP-EL包封率的影响。

2.2.3 药物与磷脂的比例 按“2.1 TP-EL的制备”项下方法分别制备药物与磷脂的质量比为1∶2、1∶5、1∶8、1∶10 的TP-EL，测定TP-EL的包封率，考察药物与磷脂比例对TP-EL包封率的影响。

2.2.4 制备温度 按“2.1 TP-EL的制备”项下方法分别制备温度为30℃、40℃、50℃的TP-EL，测定TP-EL的包封率，考察制备温度对TP-EL包封率的影响。

2.2.5 搅拌时间 按“2.1 TP-EL的制备”项下方法分别制备搅拌时间为5 min、20 min、40 min、60 min的TP-EL，测定TP-EL的包封率，考察搅拌时间对TP-EL包封率的影响。

2.3 正交设计 在单因素考察的基础上，筛选出影响脂质体包封率的3个因素：磷脂浓度(A)、磷脂与胆固醇的比例(B)、药脂比(C)。以这3个因素作为主要考察因素，每个因素又选取3个水平(表1)，采用正交设计法 L9(34)进行试验(表2)，以包封率为评价指标，优化TP-EL的处方。

2.4 TP-EL质量评价

2.4.1 TP-EL的外观 采用目测法，观察所制备的TP-EL的外观。

2.4.2 TP-EL的形态 取TP-EL适量，用水稀释10倍，用覆有碳膜的铜网沾取少量的样品溶液，滤纸吸取多余样品，然后用2%的磷钨酸溶液负染2 min，染色后的铜网自然晾干，置于透射电子显微镜下，观察TP-EL的形态。

表1 正交设计的因素水平表

表2 正交试验结果

2.4.3 TP-EL的粒径及Zeta电位 取TP-EL适量，以水为稀释介质，用激光粒度测定仪测定TP-EL的粒度及其分布和Zeta电位。

2.4.4 pH值 磷脂易氧化水解，其氧化水解速率受pH值的影响较大，只有在一定的pH范围内才比较稳定。因此，本文采用PB-10型pH计对TP-EL的pH值进行测定。

2.4.5 TP-EL的包封率 采用超滤-离心法测定TP-EL的包封率。精密量取TP-EL 1 mL置5 mL量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，取稀释后的样品，置超滤离心管中(超滤膜截留分子量50 KDa)，采用13000 rpm离心30 min，测定游离药物浓度(C游离)，另精密量取TP-EL 1 mL置5 mL量瓶中，加甲醇适量超声后，继续加甲醇稀释至刻度，测定总药量(C)，按如下公式计算，即得。包封率(%)=(C-C游离)/C×100%。

2.4.6 TP-EL中药物含量测定 采用文献报道的方法测定TP-EL中TP的含量[15]。精密称取TP-EL 1.0 mL(W，约含TP 5 mg)置 5 mL量瓶中，加甲醇适量超声后，继续加甲醇稀释至刻度。精密吸取上述溶液1 mL置25 mL 量瓶中，加蒸馏水4 mL，酒石酸亚铁溶液5 mL充分混合，再加入pH=7.5的磷酸缓冲液稀释至刻度，于533 nm处测定吸收度A1，另取TP对照品约25 mg置25 mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀后精密量取1 mL置25 mL容量瓶中，按相同方法操作后测定吸收度A2，以外标法计算药物的含量。

2.4.7 TP-EL的初步稳定性 取TP-EL置于西林瓶中，密封，在6±2℃条件下避光放置，分别于0、15 d、30 d取样，考察外观、pH值、含量及包封率的变化。

3 结果

3.1 单因素考察

3.1.1 磷脂的浓度 脂质体制剂中磷脂的浓度一般1%～5%。磷脂浓度大，脂质体粒径较大，较易发生脂质体间的絮凝、融合，导致制剂的物理稳定性较差，但载药量大，包封率高；磷脂浓度低，脂质体粒径小且均匀，制剂较稳定，但载药量小。磷脂浓度对TP-EL包封率的影响见图1a，结果表明，磷脂浓度2%～5%，随着磷脂浓度的增大，脂质体包封率逐渐增大。当磷脂浓度为4%和5%时，脂质体的包封率变化不大。

3.1.2 磷脂与胆固醇的比例 磷脂与胆固醇的比例对TP-EL包封率的影响见图1b。由图可知，在所考察的比例范围内，随着磷脂与胆固醇比例增加，TP-EL的包封率逐渐降低。当磷脂与胆固醇的比例为3∶1和5∶1时，TP-EL的包封率较高分别为70.39±0.69%和69.44±0.36%。

3.1.3 药物与磷脂的比例 脂质体的包封率和稳定性与药脂比密切相关，投药量过多，超出磷脂的承载能力，则无法形成稳定的脂质体。而药脂比过小时，载药量过低，需要给予较大体积的脂质体才能达到治疗目的，不利于实际应用。因此本文对药物与磷脂的比例进行考察，结果见图1c。结果表明，当药脂比从1∶2增加至1∶8时，TP-EL的包封率由33.09±0.35%增加至69.70±1.04%，当药脂比继续增加至1∶10时，TP-EL的包封率略有增加。

3.1.4 制备温度 本研究考察制备温度对TP-EL包封率的影响，结果见图2a。由图可知，在所考察的温度范围内，温度对TP-EL的包封率影响不大。因温度较高会加速磷脂的氧化，故选择30℃制备TP-EL。

3.1.5 搅拌时间 以包封率为评价指标考察了搅拌时间对制备TP-EL的影响。本研究分别测定了搅拌时间为5 min、20 min、40 min及60 min时脂质体的包封率，结果见图2b，当搅拌时间由5 min增加至40 min时，包封率由45.68±4.07%增加至67.91±0.53%，当搅拌时间增加至60 min时，脂质体的包封率下降至64.96±1.03%。

3.2 正交设计 正交试验结果见表2。由表2可知，各因素对脂质体包封率的影响程度为a>b>c，方差分析结果见表3，直观分析与方差分析结果一致，即a因素对TP-EL的包封率有显著的影响(P<0.05)。故确定因素最佳处方条件组合为a3b1c3，即磷脂浓度为4%、磷脂与胆固醇的质量比为5∶1、药脂比为1∶8。

表3 方差分析结果

3.3 TP-EL质量评价

3.3.1 TP-EL的外观 脂质体外观是评价其质量的一个直观标准，肉眼观察TP-EL为半透明乳状液，且带明显的乳光(图3a)。

3.3.2 形态观察 采用透射电镜磷钨酸负染法观察所制备的TP-EL的形态结构。结果见图3b，结果表明，所制备的TP-EL大多为单室脂质体。

3.3.3 TP-EL的粒径及Zeta电位 采用乙醇注入法制备的TP-EL粒径分布均匀(图4)，平均粒径为123.0±13.2 nm，PDI为0.15±0.07。TP-EL的Zeta电位为-35.2 mV，TP-EL所带相同电荷之间的排斥作用能够有效的阻止脂质体的相互聚集，提高TP-EL的聚集稳定性。

图1 a:不同磷脂浓度对TP-EL包封率的影响；b:不同磷脂与胆固醇的比例对TP-EL包封率的影响；c:不同药物与磷脂的比例对TP-EL包封率的影响

图2 a:不同温度对TP-EL包封率的影响;b:不同搅拌时间对TP-EL包封率的影响 图3 a:TP-EL的外观；b:TP-EL的形态

图4 TP-EL的粒径分布

3.3.4 pH值 磷脂易氧化水解，其氧化水解速率受环境pH值的影响较大，只有在一定的pH范围内才比较稳定。文献报道[16]，卵磷脂、大豆磷脂、磷脂酰基甘油酯等脂质成分在pH 6.5时最稳定，水解速率常数最小。本文测得TP-EL的pH值为6.25±0.14，利于脂质体和药物的稳定性。

3.3.5 TP-EL的包封率 采用乙醇注入法制备三批TP-EL，并采用超滤离心法测定包封率，测得脂质体的平均包封率为71.82±2.03%。

3.3.6 TP-EL中药物含量测定 采用紫外分光光度法对所制备的三批TP-EL中TP的含量进行测定。测得TP含量的平均值为5.19±0.17 mg/mL。

3.3.7 TP-EL的初步稳定性 TP-EL的初步稳定性试验结果见表4。结果表明，TP-EL在6±2℃条件下避光放置1个月后，与0时样品相比，脂质体未见分层，pH值及TP的含量无明显变化，但包封率略有下降，说明TP-EL长期放置物理稳定性良好。

表4 TP-EL初步稳定性

4 讨论

4.1 本研究制备的TP-EL作为一种新型经皮给药载体，具有生物相容性好、性质稳定、包封率较高、制备工艺简单的特点。采用乙醇和丙二醇组成的混合醇制备的TP-EL一方面能够通过增加醇脂质体的黏度及负电荷来提高TP-EL的稳定性，另一方面降低了乙醇在处方中所占的比例，抑制乙醇挥发且减弱了它对皮肤的刺激性。与乳膏剂及普通脂质体相比，TP-EL又能够利用醇脂质体自身的柔韧性顺利通过皮肤微孔，从而提高药物的经皮渗透性及皮肤滞留量。

4.2 胆固醇能够适当提高药物的包封率和稳定性 胆固醇的作用是调节脂质双分子层的流动性，被称为脂质体“流动性缓冲剂”。对于水溶性药物，适当提高胆固醇的比例，可以增加脂质体中内水相的体积，提高药物的包封率。通常在一定范围内磷脂与胆固醇的比例越小，脂质体包封率越高、稳定性越好。本研究制备的TP-EL包封率随着磷脂与胆固醇比例的增加而减少。当磷脂与胆固醇比例为5∶1时，形成的脂质体包封率较高为(69.44±0.36)%。

4.3 TP-EL初步稳定性考察 结果发现在6±2℃条件下避光放置1个月后，脂质体未见分层，pH值及药物含量无明显变化，但包封率有所下降。包封率下降可能是由于天然磷脂中含有不饱和脂肪酸链，易氧化和水解，使脂质体膜的性质发生改变，导致包封率下降。因此，可在制备TP-EL的过程中加入抗氧剂或将TP-EL制成冻干产品，以保证其长期稳定。