变应性鼻炎动物模型的优化*

顾晓娜 程向荣 张鹏 朱亮 滕华 王勇 胡晓燕

卵清蛋白(ovalbumin，OVA)加氢氧化铝[Al(OH)3]诱导变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是目前国际上最常用的AR造模方法之一，常以豚鼠、大鼠、小鼠及兔等为实验动物，以抓鼻、喷嚏、流涕及鼻塞等局部症状为观测指标，通过症状评分判断造模成功与否。其中，Al(OH)3佐剂的使用目的在于可较快地诱导出AR的各种过敏症状，产生高效价的IgE，但通过腹腔注射造成腹腔致敏、出现腹泻或异物性肉芽肿等其他不良反应的风险也相应升高。另外，动物模型的评估若单纯依靠肉眼观察症状，难免出现遗漏、误判。故本研究为了模拟AR自然发病过程造模，不使用含铝佐剂，只选用刺激性较小的OVA为致敏原，采取雾化吸入的方式，以易感性较强的豚鼠为实验动物，并采取冷水浸足试验模拟AR发病的环境刺激，利用监控摄像头观察症状并记录计分，对传统造模方法[1-3]进行了改良。经过造模优化，本研究的豚鼠AR模型症状评分均一，成功率较高，死亡率低，值得推广，具体报告如下。

资料与方法

1 动物造模

1.1 试剂与仪器

试剂：卵清蛋白(OVA)（美国Sigma公司，V级）；氢氧化铝[Al(OH)3]粉末（化学纯，南京化学试剂股份有限公司，批号：161114954F）；0.9%生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）。

仪器：超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，型号：402AI），恒温循环水浴槽（上海庚庚仪器设备有限公司，型号：DC0506），监控摄像头（上海小蚁科技有限公司，小蚁1080P智能摄像机）。

1.2 动物与分组

动物：成年Hartley豚鼠（清洁级）40只，雌雄各半，体重350±50g，由江苏省中西医结合医院动物房提供。动物饲养于空调房（室温20℃～26℃），可自由摄食及摄水，另外定时定量供应新鲜洁净的绿叶蔬菜，早晚12小时间断照明。

分组：将豚鼠随机分为优化组(A组)及传统组(B组)2组，每组各20只。A组采用OVA腹腔注射基础致敏、OVA雾化吸入+冷水浸足激发方法造模，采用眼眶后静脉丛采血法采血；B组采用OVA+Al(OH)3腹腔注射基础致敏、OVA滴鼻激发方法造模，末次激发后2小时行腹主动脉采血。

1.3 方法及流程

A组用OVA 30mg作致敏原，加0.9%生理盐水100ml制成溶液，腹腔注射1ml/只3次后，同等浓度致敏液腹腔注射减量至0.8ml/只4次，隔日1次，连续7次作为基础致敏。间歇5天后，将豚鼠移置半封闭透明塑料盒（体积约0.5m3）中，覆以开洞的洁净塑料盖板，以1%OVA生理盐水溶液10ml超声雾化吸入5min，每日1次，连续7次，末次雾化完成后1小时，采取冷水浸足，即固定豚鼠双下肢置入0～4℃恒温循环水浴槽中1min激发。

B组用OVA 30mg作致敏原，Al(OH)3粉末3g作佐剂，加0.9%生理盐水100ml制成混悬液，腹腔注射1ml/只，隔日1次，连续7次，为基础致敏。间歇5天后，再以2%OVA生理盐水溶液滴鼻，50μL/鼻，每日1次，连续7次激发。

2 血清IL-4含量测定

2.1 材料及仪器

一次性使用静脉血样采集容器（绿色-肝素管，辐照灭菌），一次性使用采血针，眼科手术剪，2.5ml注射器，消毒用碘伏，外科用无菌敷料；IL-4酶联免疫分析(ELISA)试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；离心机（LD5-2A，出厂编号：L350902006）。

2.2 方法

A组采用眼眶后静脉丛采血法。豚鼠及采血管做好标记后，抓紧豚鼠颈部皮肤，固定好豚鼠头部，消毒其眼眶后边缘1～1.5cm区域，并轻轻向下压迫颈部两侧，使眼球充血、外突，用一次性使用采血针针头顶端，垂直插入内眦静脉丛，另一端接采血管承接静脉血，见血液连续滴入采血管中，当达到所需血量时退出采集针，立即用无菌敷料压迫数秒止血。

B组采用腹主动脉采血法。豚鼠及采血管做好标记后，以10%水合氯醛0.03ml/kg腹腔注射麻醉动物，5min后将豚鼠仰卧位固定并消毒后，沿腹正中线剪开腹腔，2.5ml注射器刺入腹主动脉并抽取血液3ml，轻按压止血后关腹。

所有豚鼠血样经离心分装后均于-20℃冰箱中冷冻保存。用ELISA法检测豚鼠血清中IL-4的含量，过程严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

3 行为学观察

3.1 一般情况观察

2组豚鼠分笼饲养，鼠笼上方各放置1台监控摄像头，鼠笼下方垫以硬纸板，并定时更换（以便于观察二便情况）。实验期间，2台监控摄像头每日24小时持续录制，观察2组豚鼠的摄食、摄水、排便和精神活动状态，并密切观察各组动物激发后的过敏反应情况，具体参考表1[4]。

表1 豚鼠全身性致敏反应评价标准

3.2 局部症状观察

通过监控摄像头持续观察2组豚鼠鼻部症状，A组以每次雾化至雾化后2小时为主要观察时段，末次雾化即激发当日以雾化至雾化后3小时为主要观察时段；B组以每次滴鼻至滴鼻后2小时为主要观察时段。2组分别在冷水浸足激发及末次激发后2小时内记录症状并计分，评分总分大于等于5分，表示造模成功，具体参考表 2[1，2]。

表2 豚鼠鼻部症状评分标准

4 统计学分析

统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料数据采用x¯±s表示，以单因素方差分析进行统计学分析，各组数据进行正态性检验，采用t检验进行组间比较。

结果

1 行为学比较

观察发现，两组动物部分表现出全身过敏反应。其中，A组动物2只出现活动减少，余未见明显其他全身过敏反应，无动物死亡；B组动物3只出现排便次数频繁或稀便，4只出现活动减少及四肢软瘫，死亡2只。

两组动物激发后均出现典型的抓鼻、喷嚏、呼吸急促及流涕等鼻部过敏症状，A组症状评分为6.90±1.71，B组症状评分为7.40±2.37，两组差异无统计学意义(P>0.05)，具体见表3。

表 3 两组鼻部症状评分比较（x¯±s）

2 血清IL-4含量比较

造模后两组用ELISA法检测豚鼠血清中IL-4含量，结果显示：A 组 IL-4含量 35.01±4.59pg/ml，B组IL-4含量30.89±6.76pg/ml，两组比较差异有统计学意义(P=0.03)。

讨论

1 动物及致敏原

AR的造模动物品种繁多，包括大鼠、小鼠、豚鼠、兔、羊、狗等，综合考虑成本及造模周期等因素，又以大鼠、豚鼠为多。本研究因豚鼠容易致敏、血清补体丰富，性情温顺、采血方便[1，2]，故选用豚鼠为实验动物。

AR常用的致敏原包括OVA、TDI、花粉及真菌等，TDI刺激性较强[2]，花粉存在较大的地域及季节差异，真菌等其他致敏原不易制备，故本研究选用OVA进行全身及局部攻击法制备模型。关于佐剂，在使用致敏原的同时加入合适的佐剂可较快地诱导出各种症状，并且产生高效价的IgE[3]，其具体机制不明，已知含铝佐剂可在体外诱导T淋巴细胞向Th2细胞分化，促进细胞因子如IL-4等的分泌。但有研究表明传统OVA+Al(OH)3联合经腹腔注射致敏相比于不使用佐剂者，可同时促进Th1和Th2型细胞免疫反应，且所诱发的Th1型反应明显影响了Th2型反应的发生[5]。且若含铝佐剂使用不当，有发生异物性肉芽肿的风险[6]。故本研究为更贴近自然致敏过程，未使用佐剂。

2 致敏方法

2.1 雾化吸入

该给药方式为动物主动吸入药物，与动物的呼吸频率、潮气量等有关，而滴鼻给药为动物被动致敏，与操作者的操作规范及动物的配合程度密切相关，过程中存在更多不定因素。在操作过程中会发现，滴鼻激发时，豚鼠易出现呛咳、吞咽或喷嚏等现象，操作者确保专业性及动作轻柔、缓慢，这些现象亦不能完全避免，考虑豚鼠鼻腔较短而直，液滴易于直接流入鼻咽部，若滴液快速则药物极易直接滑入喉腔导致呛咳或吞咽反应，也有呛咳后出现下气道致敏引发哮喘的风险；另外，滴鼻时豚鼠可能因液滴刺激出现喷嚏反应，将药物全部喷出，或者滴鼻时因豚鼠鼻部毛发表面张力作用，导致液滴不能进入鼻腔，以上均可能达不到要求给药剂量，造成造模失败，若再次补滴，则导致给药总剂量难以控制。故本研究采用雾化吸入方式给药，药物与动物鼻腔充分接触，操作温和且可控。

有学者提出不建议使用雾化吸入激发，因为药物易吸入到下呼吸道引发支气管哮喘[7]，但有研究报道[8]，滴鼻和雾化方式都可能导致哮喘发生，滴鼻方式引起的肺部炎症浸润及细胞因子表达更明显。这说明，雾化吸入法比滴鼻给药法更温和，且有利于AR的造模。此外，鉴于临床上AR患者多为吸入变应原后，诱发一连贯过敏反应，进而出现典型的鼻部症状，故此方式更接近于AR的自然发病过程。实验过程中，应掌握给药时间及药物浓度。笔者认识到，实验后可进一步对动物的下气道进行解剖及组织学观察，使合适的雾化吸入造模方法更具说服力。

2.2 冷水浸足试验

从免疫学角度看，AR是一种由体外环境因素作用于特应性机体导致IgE介导的异常免疫反应，造成Th1和Th2免疫反应失衡为主的变应性炎症反应[9]。对于易于罹病的特应性机体，除外变应原的一些非变应原因素，包括冷热刺激、病毒感染及精神压力等都可能诱发特应性机体中Th0细胞向Th2细胞的分化，导致变应性疾病的发生[10]。已有研究认识到并尝试验证应激反应与AR发病的内在联系[11]。

本研究加入冷水浸足试验，通过动物对突发冷刺激产生的应激反应，模拟AR发病的环境刺激及紧张、焦虑情绪，接近现代人快节奏的生活状态，实验结果初步验证了该试验的可行性。

3 造模成功的判断

3.1 行为学判断

动物模型的症状评估若仅依靠肉眼观察，难免出现遗漏和误判，本研究利用摄像系统24小时记录，对豚鼠的过敏反应过程观察更全面，从而可获取更客观、可靠的症状评分。同时，可以观察豚鼠有无出现其他全身性过敏反应，通过对其一般情况的评估，获得更稳定的动物模型。

3.2 血清IL-4含量测定

AR病程中Th细胞趋于向Th2细胞分化，并释放出大量Th2细胞因子。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13 等，还可抑制 IFN-γ 的产生，其中IL-4最具代表性，主要参与免疫应答及急性期反应。因此，本研究通过测定细胞因子IL-4以辅助判断动物造模成功与否。

此外，动物模型的实验评价还可通过动物鼻腔黏膜的组织病理学观察、被动皮肤过敏试验、血清及鼻腔灌洗液IgE、sIgE、sIgG的测定及IFN-γ、IL-10、IL-13等其他细胞因子的测定等诸多方法实现，本研究鉴于时间因素限制，未作更多评价，存在不足。

4 采血方法

实验动物的采血方法很多，适用于豚鼠的就有眼眶后静脉丛采血、颈静脉采血、腹主动脉采血、心脏穿刺采血及尾尖采血等数种[12]。本研究优化组采用眼眶后静脉丛采血法，该法采血血流快，创口小、愈合快、不损伤器官，简单易学、便于操作，且不易溶血，可反复多次采集、多次采血质量较高，适用于实验过程中需要重复多次采血的研究，可克服病理学评价需处死动物取材、不利于实际操作的缺点[1，11]。因豚鼠体质娇嫩，若采血量和采血次数频繁，可能引起应激反应及采血部位的损伤，故操作时需注意：①准确掌握入针点，尽量避免入针后再调整角度，若入针角度不理想，应换针后另行采血；②准确掌握针头进入眼眶后的深度，过浅则不能充分置入眼眶后静脉丛，导致血流小且易凝血，过深则易损伤眼球后组织。传统组采用常用的腹主动脉采血，该法操作复杂、技术要求高，若不控制好麻醉深度易致动物心脏骤停、出血及躁动不安等，无菌要求高，对动物损伤及刺激较大，可能对后续实验结果产生不良影响。

综上所述，本研究通过以下几点对传统AR模型进行造模优化：①模拟AR的自然发病过程，不使用含铝佐剂，只选用刺激性较小的OVA作为致敏原，采用雾化吸入方式激发，动物模型症状一致性良好，死亡率低；②加入冷水浸足试验，通过突发冷刺激制造豚鼠紧张情绪，模拟现代人的压力及焦虑状态；③通过眼眶后静脉丛采血法采血，简单、易操作，损伤小、可重复，不影响后续实验；④行为学观察利用摄像系统24小时记录，对豚鼠的过敏反应过程观察更全面，症状评分更客观、可靠。另外，笔者建议造模宜选择AR好发的春季，避开肺病高发的冬季，对动物的饲养环境应由专人严格控制。