5-氮杂胞苷对肺癌细胞株功能影响及其机制

许银辉 赖麒 张小影 陈强 唐亮 刘栋 杜振宗

桂林医学院第二附属医院胸心外科（广西桂林 541199）

DNA甲基化是表观遗传学的核心组成部分，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）是细胞生长过程中的重要组成酶之一，与肿瘤生长、转移及凋亡密切相关［1]。5-氮杂胞（5-Aza-dC）是一种DNA甲基转移酶抑制剂，在口腔癌、结肠癌、宫颈癌等［2-4]的表观治疗中可使p16、MGMT和PTEN等抑癌基因高甲基化逆转而得以正常表达。RASSFA基因在正常肺细胞中有表达，在肺癌细胞株中存在高甲基化率，将该基因去甲基化的A549细胞株接种于裸鼠后其肿瘤生长明显缩小［5]；APC基因蛋白调节β-catenin蛋白胞质内降解，是Wnt信号通路的组成部分，其失活后能激活cmyc、CyclinD1等成瘤基因［6]。然而，有关5-Aza-dC治疗后，DNMT1、RASSF1A和APC基因甲基化在肺癌细胞株中的改变情况报道尚少。基于此，本研究选取临床标本验证DNMT1在体内的表达，并运用非小细胞肺癌细胞株A549、H358和正常肺上皮细胞株BEAS-2B，通过5-氮杂胞处理后，观察其生长、侵袭和凋亡的变化，检测RASSFA、APC和DNMT1基因的转录和表达，来进一步探讨3种基因改变特点。

1 材料与方法

1.1 材料细胞株A549、H358、BEAS-2B购于南京科佰生物科技有限公司（上海）；达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、10%胎牛血清购于美国强生公司，Hoechst 33342、5-氮杂胞苷采自美国Sigma-Aldrich公司；抗DNMT1、RASSFA，、APC和GAPDH抗体购买于赛信通（上海）生物试剂有限公司；AmpliTaq Gold®购自北京泰泽瑞达科技有限公司；TBST、PBS试剂购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室购买于康宁（中国）有限公司；荧光显微镜（奥林巴斯IX71，日本奥林巴斯公司）；流式细胞仪购买于美国BD公司；RT-PCR试剂盒购买于北京嘉美纽诺生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养3种细胞株先经复苏，接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液的无菌瓶中，后放置于37℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养，每3天换液及加药1次，处理生长至80%时的细胞以0.1%的胰蛋白酶消化，收集对数期的细胞继续传代或提取蛋白。

1.2.2 赫斯特染色荧光显微镜观察A549和H358细胞系用5-氮杂胞苷处理后培养在37℃的培养箱中24和48 h，后用0.1μg/mL Hoechst 33342（激发波长365 nm）加到细胞培养基中，染色DNA后室温放置3～5 min，吸去染液，用TBST和PBS洗涤2～3次，每次3～5 min，封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，荧光显微镜检测会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染的变化。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡处理后的细胞株A549和H358用PBS缓冲液收集和悬浮，通过抗溴脱氧尿嘧啶核苷的单克隆抗体对DNA进行染色。离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次，加入预冷的70%乙醇，于4℃固定过夜，细胞染色：离心收集细胞，用1 mL PBS洗细胞一次，加入500μL PBS重悬，4℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞株凋亡率，结果用软件Modfit分析。

1.2.4 Transwell方法检测细胞迁移能力 用8 μmol/L孔径的transwell小室检测A539和H358细胞的迁移能力：在transwell下层小室中加入500 μL含10%的DMEM培养基作为趋化剂，然后向上室加入200μL含6×104细胞于1%FBS的1640培养基，每组设置3个复孔，培养24 h后用棉签擦拭去除transwell上层小室尚未迁移的细胞。将小室下层中的细胞用结晶紫固定并于倒置显微镜下计数细胞。随机取4个不同镜下视野计数细胞，实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测DNMT1蛋白的表达上述培养条件下培养细胞，当A549、H358和BEAS-2B细胞贴壁生长到汇合率达80%，选择生长形态好贴壁牢固的细胞进行传代，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态；3 d传代1次，最终收集细胞。用蛋白裂解液提取蛋白上清液后，分别收集各组蛋白，以BCA法蛋白定量，获取所得25μg蛋白与5×蛋白上样缓冲液按照体积4∶1混合，煮沸8 min致变性，后SDS-PAGE电泳，利用PVDF膜湿转250 mA、120 min，密闭1 h，TBST洗膜，加入DNMT1抗体，温度设置4℃静置过夜，后用二抗常温孵育1 h，TBST洗涤，ECL荧光显色后暗室曝光洗片，用Lab Works软件进行灰度分析，记录结果。

1.2.6 RT-PCR检测DNMT1、RASSFA和APC基因转录的mRNAA549、H358和BEAS-2B分别用5-氮杂胞苷（3μmol/L）处理24和48 h，收集前后的各组细胞，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，后进行反转录为cDNA，反应体系：5×reaction buffer 4 μL（Mg2＋10 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）2 μL、Oligo dT 1 μL、RNAse Inhibitor 1 μL、DTT（0.1 mol/L）2μL、总RNA 3μL和M-MLV 反转录酶1μL，DEPCtreated water 6μL；混匀后37℃水浴60 min，然后72℃水浴15 min，4℃暂存10 min，合成的cDNA存放-20℃冰箱备用。RT-PCR反应体系（25 μL）：2×SYBR Premix ExTaq TM 12.5μL，四基因（GAPDH为内参照）上、下游引物（10 pmol/L）各1 μL、cDNA 1μL和ddH2O 6.5μL，反应条件为95℃变性45 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s，共32个循环。取3次实验均值。采用2-ΔΔCT法分析RASSFA、APC和DNMT1基因mRNA在细胞中的表达情况，引物序列见表1。非小细胞肺癌和非癌组织RNA的提取遵循无酶原则，分别取约80 mg癌和非癌组织，加入Trizol液匀浆，加入0.2 mL的氯仿分离，离心后取上层水相，后加入预冷75%无酶乙醇洗脱，再溶解提纯，行RT-PCR检测DNMT1的mRNA的量。

1.2.7 统计学方法采用SPSS17.0软件用于统计分析，实验数据用Microsoft Excel 2007登记。数据结果采用非配对t检验或Mann-WhitneyU检验去比较两组数据，多组比较用单向方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义，实验至少重复3次。

表1 引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 结果

2.1 5-氮胞苷处理后，A549、H358细胞株的生长、侵袭和凋亡通过直方图，A549和H358表观治疗24和48 h后细胞增殖能力下降明显，随着时间延长，细胞阻滞数目越多（图1A）；赫斯特染色实验组的两细胞株胞浆浓缩，染色质固缩，细胞数目减少，凋亡增加；Transwell方法发现A549和H358细胞株进入下室的细胞数目随着时间减少（图1B、1C），结果表明5-氮杂胞苷是能够有效地抑制肺癌A549和H358细胞株的生长、侵袭和凋亡，随着时延长，抑制作用越明显。

图1 A549、H358细胞株的生长、侵袭和凋亡情况Fig.1 Growth、invasion and apoptosis of A549 and H358 cell lines

2.2 临床标本和细胞株相关基因的表达收集桂林医学院附属医院确诊为非小细胞肺癌的20例标本行RT-PCR分析，DNMT1在非小细胞肺癌中比相应的非癌组织中mRNA转录明显上调（图2A）；在A549、H358和BEAS-2B细胞株中，DNMT1在mRNA和蛋白水平均有较高的表达，并且A549的表达量（3.54±0.46）要比H358（3.02±0.20）高（P＜0.05），差异有统计学意义（图2B、2C）；经过5-氮杂胞苷处理24和48 h后的A549、H358细胞株中DNMT1的表达能够明显被削弱，RASSFA和APC基因表达量在A549和H358中作用24和48 h分别为（1.002 ± 0.080）、（2.226 ± 0.132），（1.002 ±0.073）、（2.491 ± 0.063）和（1.000 ± 0.035）、（2.12 ±0.039），（1.001 ± 0.67）、（2.124 ± 0.086）。RASSFA和APC基因在两细胞株中能够随着时间延长而表达增加，统计学分析RASSFA基因在A549细胞株中表达较高，APC基因在H358细胞株中表达较高，A549蛋白表达较H358表达高（P＜0.05），差异有统计学意义（图2D、2E、2F）。结果表明DNMT1抑制剂5-氮杂胞苷能够抑制DNMT1基因而使肿瘤抑制基因RASSFA和APC重新表达，与细胞功能试验结果吻合，印证5-氮杂胞苷抑制细胞功能过程中，有RASSFA、APC基因上调和DNMT1基因下调有关。

图2 DNMT1、RASSFA、APC基因转录和表达情况Fig.2 Transcription and expression of DNMT1，RASSFA and APCGenes

3 讨论

DNMT1甲基化转移酶定位于染色体19p13.3-p13.2，拥有1 620个氨基酸，其cDNA全长5 434个碱基对，是哺乳动物细胞中含量最多的DNA甲基化转移酶，其在肿瘤细胞中活性较其他转移酶高。文献［7-8]表明，DNMT1在胃癌、胰腺癌、口腔癌、卵巢癌和喉癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，表达增加的DNMT1作用于抑癌基因的CpG岛使其DNA甲基化异常增加，使得抑癌基因得不到正常表达，从而促使肿瘤细胞增殖。抑癌基因甲基化程度从正常肺组织到癌前病变再到肺癌呈明显增加的趋势，某些基因的高甲基化可能使肿瘤细胞具有易于转移的潜能。ZHANG等［9]进行的一项针对肺癌患者20个抑癌基因甲基化状态的研究结果显示，APC、RASSFA、SFRP1、RARβ和P16基因在癌组织中明显高甲基化，甲基化的程度与病情的发展、淋巴结的转移等密切相关。本研究采取临床标本行RT-PCR结果表明DNMT1在肺癌组织中与其他肿瘤研究一样呈现高表达；DNMT1基因转录蛋白在肺癌A549和H358细胞株的表达明显高于正常上皮细胞的表达，表明DNMT1是促癌基因，甲基化程度较低。给予甲基化抑制剂5-氮杂胞苷后，RASSFA和APC基因蛋白表达明显增加，与时间呈正比，导致两肺癌细胞株细胞功能降低。这预示着5-氮杂胞苷能使抑癌基因启动子区域出现去甲基化，恢复抑癌基因的正常表达，启动肿瘤细胞的自杀负调控机制。因此，去除肿瘤抑制基因的高甲基化状态，有利于恢复肿瘤抑癌基因。

DNMT1抑制剂5-氮杂胞苷能够通过使肿瘤抑制基因去甲基化而抑制癌基因翻译和转录，从而阻止肿瘤生长和侵袭。在两组细胞株A549和H838中，刘邦卿等［10]研究得出通过5-氮杂胞处理后，DNMT1基因的mRNA和蛋白表达水平明显下降，但其变化是否对相关抑癌基因甲基化改变和表达无进一步研究。本研究结果表明A549和H358中DNMT1活性降低，RASSFA和APC基因能够重新表达，并且A549中RASSFA较明显，H358中APC较明显，同时A549的表达量要比H358高，该研究弥补了其实验无深入研究的不足。因此，DNMT1可以作为非小细胞肺癌表观治疗的预后标记物。綦晓艳等［11]研究得出5-氮杂胞苷可以逆转DR4基因甲基化状态，促使肺癌细胞的凋亡，我们实验表明5-氮胞苷沉默DNMT1后也能抑制细胞生长，诱导A549和H358细胞凋亡，或许与5-氮杂胞苷逆转RASSFA和APC基因启动子区域甲基化状态有关。不过，目前有关5-氮杂胞苷在肿瘤细胞侵袭转移中的机制尚不完全明确，本实验结果表明其能够使A549和H358生长及侵袭力减弱，并促进凋亡。

综上所述，肺癌组织中DNMT1基因高表达，表观治疗可使肺癌A549和H358细胞株中DNMT1基因表达降低，在前人基础上得出抑癌基因RASSFA和APC表达升高，导致癌细胞功能下降，可能预示5-氮杂胞苷能够诱导RASSFA和APC启动子区域去甲基化，从而抑制肺癌肿瘤细胞的增殖、生长和侵袭。不过，5-氮杂胞苷抑制肿瘤细胞的机制能否引起癌基因甲基化增加，仍需进一步研究。另外，本研究只是进行了体外实验，缺乏体内实验的有力支持，下一步值得探讨5-氮杂胞苷对肺癌动物模型的作用效果，以及5-氮杂胞苷联合其他抗肿瘤药物治疗的有效性。