Smac/DIABLO在子宫内膜癌中的表达及促凋亡机制

王晓华 张玉娟

承德医学院附属医院妇科（河北承德 067000）

子宫内膜癌发病率逐年上升，呈现出年轻化趋势［1]。子宫内膜癌的发生、发展是一个多阶段、多基因调控异常的过程，寻找与其密切相关的特异性分子标志物，对内膜癌患者进行早期诊断、早期治疗，成为妇科肿瘤领域的研究热点。Smac/DIABLO又称为低等电位点的凋亡抑制蛋白的直接结合蛋白，位于12号染色体长臂，由7个外显子组成。目前研究发现［2-5]Smac/DIABLO的表达和多种肿瘤的进展呈明显负相关，而Smac/DIABLO在子宫内膜癌发生、发展中的作用及其机制鲜有报道。本研究通过检测Smac/DIABLO在不同子宫内膜组织中的表达，研究Smac/DIABLO在子宫内膜癌发生、发展中的作用，并通过构建过表达Smac/DIABLO的Ishikawa细胞模型，检测相关蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的表达，探讨Smac/DIABLO在子宫内膜癌中发挥作用的可能机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2014年12月至2016年3月承德医学院附属医院行手术治疗的子宫内膜癌患者新鲜内膜组织共46例，依据手术病理分期（FIGO，2009年）其中Ⅰ期28例、Ⅱ期12例、Ⅲ期6例，有淋巴结转移8例、无淋巴结转移38例，高分化34例、中分化8例、低分化4例，均获得病理学确诊为子宫内膜样腺癌。同期收集新鲜正常内膜组织30例，非典型增生内膜组织24例。标本离体后迅速放入液氮中，再转至-80℃冰箱保存。患者年龄为40～65岁，平均（55.2±6.7）岁，术前均未接受放化疗及激素治疗。所有标本收集均经伦理委员会同意，签署患者知情同意书。

1.2 主要材料及试剂子宫内膜高分化腺癌Ishikawa细胞购自南京凯基公司，胎牛血清（FBS）、PRMI 1640培养基购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，Trizol购自美国Ambion公司，RT-PCR逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，荧光定量试剂盒购自美国Invitrogen公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自联科生物公司，Smac/DIABLO、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9兔单克隆抗体，β-actin鼠多克隆抗体购自英国abcam公司。

1.3 qRT-PCR检测Smac/DIABLO mRNA表达Triol法提取各组总RNA，以1μL RNA为模板，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA第1条链，应用荧光定量试剂盒进行qRT-PCR反应。Smac/DIABLO和GAPDH引物序列由大连宝生物公司设计合成，Smac/DIABLO上游引物序列5′-CGCAGATCAGGCCTCTATAACC-3′，下游 5′-CCCCTTCCTCCTGTGTTTTCT-3′，扩增产物149 bp；GAPDH上游引物序列 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，扩增产物 138 bp。反应条件：95℃ 3 min 1循环，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃30 s共35循环。用2-△△ct方法计算目的基因Smac/DIABLOmRNA相对表达量。

1.4 细胞培养及转染Smac/DIABLO的过表达质粒pcDNA3.1-Smac和空载体对照质粒由苏州吉玛公司构建。Ishikawa细胞培养在含10%FBS的PRMI 1640培养基中，转染前24 h将细胞均匀接种于6孔板，密度为4×105个/mL。按Lipofectamine 2000说明书配制转染试剂。实验分为过表达组、空载体对照组和空白对照组，过表达组转染pcDNA3.1-Smac过表达质粒，空载体对照组转染Smac空载体对照质粒，空白对照组加入10%FBS。转染24 h后荧光显微镜下观察并计算转染效率。

1.5 Western blot检测Smac/DIABLO、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表达转染后48 h，将细胞加入RIPA充分裂解后离心，取上清液进行BCA蛋白定量。蛋白变性后取40μg进行凝胶电泳，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗（1∶1 000）4℃过夜，二抗（1∶3 000）孵育1 h。ECL超敏化学发光液显影，采用Tanon 6100化学发光图像分析系统进行成像并进行定量分析，目的蛋白Smac/DIABLO与内参蛋白β-actin的光密度比值，计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法应用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料用表示，采用单因素方差分析和两独立样本t检验，多组数据间比较釆用q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Smac/DIABLO mRNA表达3组患者年龄、血压和体质指数比较差异无显著性（P＞0.05）。子宫内膜癌组、非典型增生组和正常内膜组，Smac/DIABLO mRNA相对表达量分别为0.325±0.024、0.792±0.064、1.000±0.000，子宫内膜癌组Smac/DIABLO mRNA相对表达量明显低于非典型增生组和正常内膜组，经单因素方差分析，差异具有统计学意义（F=162.493，P=0.007）。

2.2 Smac/DIABLO mRNA表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系子宫内膜癌组织中Smac/DIABLO mRNA的表达与FIGO分期、淋巴结转移及肌层浸润深度有关（P＜0.05），与年龄、组织分化程度无关（P＞0.05）。FIGO分期越高、肌层浸润程度越深、淋巴结转移阳性，Smac/DIABLOmRNA表达量越低。见表1。

表1 Smac/DIABLOmRNA的表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系Tab.1 Relationship between Smac/DIABLOmRNAexpression and clinicopathological parameters of endometrial±s

表1 Smac/DIABLOmRNA的表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系Tab.1 Relationship between Smac/DIABLOmRNAexpression and clinicopathological parameters of endometrial±s

参数年龄（岁）≤60＞60肌层浸润深度＜1/2≥1/2组织分化程度高分化中+低分化FIGO分期Ⅰ+ⅡⅢ淋巴结转移有 无例数34 12 32 14 38 8 40 6 8 3 8 Smac/DIABLOmRNA相对表达量0.314±0.012 0.336±0.016 0.392±0.009 0.227±0.011 0.368±0.013 0.398±0.015 0.296±0.004 0.215±0.007 0.194±0.006 0.324±0.011 t值0.382 1.425 0.576 1.798 5.623 P值0.625 0.023 0.814 0.006 0.018

2.3 转染效率检测转染24 h后，荧光显微镜下观察细胞内强弱不等的绿色荧光，分别拍摄同一明暗视野下的细胞图片，根据转染效率（%）=暗视野绿色荧光细胞数/明视野细胞数，计算得出转染效率约为80%。见图1。

图1 细胞转染图（×200）Fig.1 Cell transfection map（× 200）

2.4 转染后Smac/DIABLO蛋白表达过表达组、空载体对照组和空白对照组Smac/DIABLO蛋白相对表达量分别为0.628±0.011、0.264±0.007、0.242±0.004，过表达组Smac/DIABLO蛋白相对表达量明显增加，经单因素方差分析，差异具有统计学意义（F=85.628，P=0.008）。说明转染Smac/DIABLO过表达质粒，可增强Smac/DIABLO在Ishikawa细胞中的表达。

2.5 转染后相关蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9表达过表达组Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白相对表达量比较空载体对照组和空白对照组明显增加，经单因素方差分析，差异具有统计学意义（P＜0.01，P＞0.05）。见图2、表2。

图2 转染后各组Caspase-3,7,9蛋白条带图Fig.2 Caspase-3,7,9 protein bands in each group after transfection

表2 转染后各组Caspase-3，7，9蛋白相对表达量Tab.2 The relative expression of Caspase-3，7，9 protein in each group after transfection（n=6）±s

表2 转染后各组Caspase-3，7，9蛋白相对表达量Tab.2 The relative expression of Caspase-3，7，9 protein in each group after transfection（n=6）±s

组别过表达组空载体对照组空白对照组F值P值Caspase-3 0.664±0.012 0.375±0.007 0.392±0.004 42.640 0.006 Caspase-7 0.428±0.005 0.247±0.003 0.269±0.007 108.452 0.002 Caspase-9 1.228±0.027 0.824±0.012 0.896±0.016 179.265 0.018

3 讨论

人类Smac/DIABLO基因在肿瘤的发生、发展过程中发挥了重要作用。XUE等［6]研究发现，Smac/DIABLO在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺纤维瘤组织。THORSTEN等［7]研究发现，Smac/DIABLO在膀胱癌患者中的表达仅为正常人的1/2，并且Smac/DIABLO高表达组患者的五年生存率明显高于低表达组。同样Smac/DIABLO在肾癌［8]、胰腺癌［9]、卵巢癌［10]中的表达量较正常组织均明显减低。本研究发现，Smac/DIABLO mRNA在子宫内膜癌中的表达明显低于非典型增生组和正常内膜组（P＜0.01）。Smac/DIABLO在子宫内膜癌组织中的表达与FIGO分期、淋巴结转移及肌层浸润深度有关（P＜0.05），FIGO分期越高、肌层浸润程度越深、淋巴结转移阳性，Smac/DIABLOmRNA表达量越低，与年龄和组织分化程度无明显相关性（P＞0.05）。

肿瘤的发生与细胞凋亡受阻有关，细胞凋亡受阻有利于转化突变的细胞发生积聚性生长，使细胞生存期延长［11]。细胞凋亡存在内源性和外源性两条通路，分别称为线粒体介导通路和死亡受体介导通路。含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteine aspartic acic specitic protease，Caspase）家族作为细胞凋亡的主要执行者，在不同的凋亡通路发挥作用。其中Caspase-3和Caspase-7是线粒体介导通路和死亡受体介导通路共同的天冬氨酸特异性蛋白酶，Caspase-9是线粒体介导通路的始动因子［12]。Smac/DIABLO可与凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的杆状病毒IAP重复区（baculoviral IAP repeat，BIR）结合，消除 IAPs对 Caspase的抑制作用，达到抑制细胞增殖、促进凋亡的作用［13-14]。本研究应用脂质体法将Smac/DIABLO的过表达质粒pcDNA3.1-Smac转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞，荧光显微镜下观察计算转染效率约80%，转染后过表达组Smac/DIABLO蛋白相对表达量明显增加（P＜0.01），说明过表达Smac/DIABLO的Ishikawa细胞模型构建成功。Western blot结果显示，转染后Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表达量均明显增加（P＜0.05），说明Smac/DIABLO可能在线粒体介导通路和死亡受体介导通路两条途径发挥作用，解除IAPs对Caspase的抑制作用，促进细胞凋亡。

综上所述，Smac/DIABLO与子宫内膜癌的发生、发展呈负相关，推测其通过内源性和外源性两条凋亡通路发挥作用，可为子宫内膜癌的预后判断及治疗提供新的靶点。但细胞凋亡是多通路、多基因共同作用的结果，Smac/DIABLO发挥作用的具体机制尚不明确，还需对Smac/DIABLO及凋亡通路相关基因进一步深入研究。