Endophilin A2通过调节PTEN/Akt通路对心肌细胞急性缺血损伤的影响

沈焕嘉 莫沁杏 陈玉柳 刘芸

广州医科大学药学院药理教研室（广州 511436）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一种发病率和致死率较高的缺血性心脏病，表现为持续缺血缺氧，从而导致心肌细胞损伤和左室重构，严重时可导致心衰，是严重危害公众健康的心血管疾病［1]。其中心肌细胞凋亡是导致心肌细胞死亡的重要原因之一［2-3]。在AMI过程中，炎症反应和氧化应激等都会引起心肌细胞凋亡，从而造成心肌损伤。因此，深入研究AMI的分子机制，寻找减轻心肌缺血损伤、逆转心肌重构的有效靶点，具有十分重要的意义。

Endophlin A2（EndoA2）是一种突触头端接触蛋白，一般认为与细胞内吞作用有关，广泛分布于各组织中［4]。最近的研究表明，EndoA2可通过SH3结构域与ClC-3结合，调节ClC-3在胞浆胞膜的分布，进而调控容积调节型氯电流开放，调节血管重构［5]。另外也有研究表明，EndoA2参与调节巨噬细胞泡沫化［6]。本课题组的前期研究也证实，EndoA2通过抑制Bax从胞浆转位线粒体，减少细胞色素C的释放，进而抑制过氧化氢诱导的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞凋亡［7]。上述研究表明，EndoA2与心血管疾病密切相关。然而，EndoA2是否参与调节AMI后心肌重构过程，至今尚未有报道。本研究采用氧葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）诱导心肌细胞急性缺血损伤，探讨EndoA2对心肌细胞急性缺血损伤的影响，并初步探索PTEN/Akt信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibico公司。Ad-EndoA2腺病毒委托上海生博生物医药科技有限公司合成并完成滴度测定。EndoA2干扰链及转染试剂购自美国Qiagen公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自武汉凯基公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒购自碧云天。Caspase-3、PTEN、p-PTEN、PDK1、p-PDK1、Akt、p-Akt购自美国Cell Signaling Technology公司。鼠单抗GAPDH、Ⅱ抗山羊抗兔（IgG）和Ⅱ抗山羊抗小鼠（IgG）购自中杉金桥生物技术有限公司。其他生化试剂均为进口分装或者国产分析纯。

1.2 主要方法

1.2.1 细胞培养及分组H9C2心肌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37℃和5%CO2的环境下培养。待细胞融合度达80%以上用0.25%胰酶消化传代。在各实验处理结束前12 h进行OGD处理。弃原有培养基，PBS清洗细胞3遍，加入适量DMEM低糖培养基，放置于37 ℃三气缺氧（N2∶CO2∶O2＝94%∶5%∶1%）培养箱内缺氧12 h。

1.2.2 干扰链与腺病毒转染参照文献［7] 进行转染。待细胞融合度为30%～40%，取100μL DMEM高糖培养基稀释10μL hiperfect，再加入20 nmol/L的干扰链。室温混合10 min，将混合物均匀加入含有1.9 mL培养基的小皿中，放入培养箱中进行培养。6 h后换为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，继续培养48 h用于后续实验。

细胞接种于培养皿中，第2天细胞密度约为40%～50%，取100μL无血清无抗生素的培养基稀释病毒使MOI值适合于实验，加入含有900μL培养基的培养皿中。6 h后换为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，继续培养48 h后用于后续实验。

1.2.3 CCK-8检测细胞存活率参照CCK-8试剂盒说明书操作，将细胞以每孔104的密度在96孔板中培养24 h，经过不同处理后，加入CCK-8（10μL/孔）于37℃孵育4 h。通过酶标仪在450 nm波长下检测吸光度值（OD），并计算细胞存活率，计算公式为：细胞存活率（%）=（处理组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡率按照试剂盒说明书操作。细胞悬液在4℃、1 000 r/min离心10 min，弃上清，清洗两遍后加入1×binding buffer（5× 105～ 5× 106细胞/mL）。分别向混合悬液加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻柔混匀，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blotting检测相关蛋白的表达根据参考文献［8] 检测PTEN、PDK1、Akt、GAPDH及Caspase-3蛋白的表达情况。简而言之，PBS清洗细胞后，加入裂解液和蛋白酶抑制剂裂解30 min，然后12 000 r/min离心12 min，取上层清液。采用BCA法进行蛋白定量，并制成蛋白样品。经SDSPAGE分离蛋白，电转至PVDF膜上，用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST漂洗2次后，用3%BSA/TBS稀释Ⅰ抗4℃孵育过夜。第2天TBST漂洗3次后，Ⅱ抗室温孵育1～2 h，TBST漂洗3次。经ECL显色液曝光成像，分析条带。

1.3 统计学方法用GraphPad Prism 5.0统计软件进行t检验或者单因素方差分析（one way ANOVA）。数据均以表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EndoA2提高OGD后心肌细胞的存活率为了探讨EndoA2对OGD处理后心肌细胞存活情况的影响，在H9C2心肌细胞上转染EndoA2 siRNA沉默EndoA2或转染Ad-EndoA2过表达EndoA2，再OGD处理6 h，CCK-8检测H9C2心肌细胞存活率。结果显示，OGD处理后细胞存活率降低，沉默EndoA2细胞存活率进一步降低，而过表达EndoA2细胞存活率明显升高。与OGD组相比，转染Ad-lacZ或negative，细胞存活率无明显变化。见图1。结果表明EndoA2可提高OGD后心肌细胞的存活率。

2.2 EndoA2抑制OGD诱导的心肌细胞凋亡为了探讨EndoA2对心肌细胞凋亡的影响，用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示单纯转染Ad-EndoA2或siRNA对心肌细胞凋亡无明显影响。OGD处理后心肌细胞凋亡率明显增加，沉默EndoA2进一步促进OGD诱导的心肌细胞凋亡，而过表达EndoA2则抑制OGD诱导的心肌细胞凋亡。见图2。结果表明EndoA2可明显改善OGD诱导的心肌细胞损伤。

图1 EndoA2提高OGD后心肌细胞的存活率Fig.1 EndoA2 increased the cell viability of cardiomyocytes after OGD

2.3 Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3的表达为进一步探讨EndoA2对心肌细胞凋亡的影响，用Western blotting检测凋亡蛋白Caspase-3的表达情况。结果显示，OGD处理后，活化的Caspase-3表达增多，与OGD组相比，沉默EndoA2进一步促进Caspase-3活化，而过表达EndoA2则抑制Caspase-3活化，见图3。结果进一步证实EndoA2可改善OGD诱导的心肌细胞损伤。

图2 EndoA2抑制OGD诱导的心肌细胞凋亡Fig.2 EndoA2 inhibited the apoptosis of cardiomyocytes induced by OGD

2.4 EndoA2通过调节PTEN/Akt通路抑制心肌细胞急性缺血损伤为了探讨EndoA2抑制心肌细胞急性缺血损伤的分子机制，采用Western blot检测PTEN/Akt通路相关蛋白的表达。结果显示，OGD促进PTEN磷酸化，抑制PDK1和Akt磷酸化。沉默EndoA2进一步促进OGD诱导的PTEN磷酸化，抑制PDK1和Akt磷酸化，过表达EndoA2则发挥相反的作用，见图4。

图3 EndoA2抑制OGD诱导的Caspase-3活化Fig.3 EndoA2 inhibited the activation of Caspase-3 induced by OGD

图4 EndoA2对PTEN/Akt通路的影响Fig.4 The effect of EndoA2 on PTEN/Akt signaling pathway

3 讨论

AMI是一种严重危害人类健康的缺血性心脏病。主要由于冠状动脉狭窄，导致心肌供血不足，从而出现心肌代谢功能障碍和结构损伤，最终导致心肌重构以及心功能异常［9]。心肌重构是心功能逐步下降导致心衰的重要病理生理学基础，包括梗死区心肌细胞缺血坏死、室壁纤维化和变薄以及非梗死区胶原沉积［10]。临床上对于AMI的治疗措施主要是一些补救性的治疗方法，在减轻心肌损伤，逆转心肌重构等方面存在明显的不足。因此，寻找特异性逆转心肌重构，保护缺血心肌的分子靶点，对改善AMI后心脏预后具有十分重要的意义。

Endophilin是在筛选小鼠胚胎基因cDNA文库时，因含有一个富集多聚脯氨酸的SH3结构域而被发现［11]。Endophilin由两个亚型组成，分别是endophilin A和endophilin B。EndoA2作为其中的一个成员，被广泛报道可以和内吞蛋白结合，影响膜的内陷、裂变到晚期的脱壳，参与网格蛋白介导的内吞过程［12-13]。另外的研究表明，EndoA2的SH3结构域与BPGAP1富集脯氨酸的结构域结合调节表皮生长因子受体的内吞［14]。EndoA2的SH3结构域与单克隆非特异性抑制因子β结合，抑制酵母多糖的吞噬［15]。除了内吞功能，EndoA2的非内吞功能也被广泛报道。EndoA2可以促进容积调节型氯通道蛋白ClC-3从胞浆向胞膜转运，进而促进平滑肌细胞增殖，调节血管重构［5]。本课题组的前期研究也证实EndoA2通过抑制Bax从胞浆转位线粒体，抑制线粒体通路诱导的平滑肌细胞凋亡，调节血管重构［7]。此外，EndoA2还可以调节巨噬细胞泡沫化［6]。以上研究证实，EndoA2对动脉粥样硬化、血管重构等心血管疾病具有重要的调节作用。那么，EndoA2是否能够改善心肌急性缺血损伤，进而影响AMI后心肌重构呢？

在本课题中，笔者通过OGD建立心肌细胞急性缺血模型。结果显示，过表达EndoA2明显抑制OGD诱导的心肌细胞凋亡，沉默EndoA2则进一步促进OGD诱导的心肌细胞凋亡。EndoA2改善心肌急性缺血损伤的分子机制尚不清楚，值得进一步研究。PI3K是一个调节细胞生长的重要因子，在糖尿病心肌病、缺血/再灌诱导的心肌损伤以及心肌肥大模型中，PI3K/Akt通路被激活［16]。PTEN是调节PI3K活性的负性调节子。研究表明，失活PTEN明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大［17]。此外，在缺血心肌，TIEG1通过调节PTEN/Akt通路，改善缺血诱导的心肌损伤［18]。以上结果提示PTEN在心血管疾病的病理生理过程中具有重要作用。那么，PTEN在EndoA2改善心肌急性缺血损伤过程中是否发挥调控作用呢？为了解决这个问题，本研究采用Western blotting的方法检测了PTEN、PDK1以及Akt的表达情况。结果发现，过表达EndoA2抑制PTEN磷酸化，促进PDK1和Akt磷酸化，沉默EndoA2则发挥相反的作用。提示PTEN/Akt通路参与了EndoA2改善心肌急性缺血损伤过程。

综上所述，本研究发现EndoA2明显抑制OGD诱导的心肌细胞凋亡，表明EndoA2具有改善心肌细胞急性缺血损伤的作用，其机制可能与PTEN/Akt通路相关。本文通过对EndoA2调节PTEN/Akt通路抗心肌急性缺血损伤的机制研究，为改善AMI后心肌重构提供新的治疗策略。