二苯乙烯苷对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

李品玉 刘其礼 张嫄怡 杨坚 郑恒

肇庆医学高等专科学校病理学与病理生理学教研室（广东肇庆 526000）

大肠癌是发生在大肠黏膜上皮的恶性肿瘤，包括结肠癌（colorectal cancer，CRC）与直肠癌（rectal cancer，RC），是全球最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和病死率均居所有恶性肿瘤第5位［1]。虽然针对结直肠癌的治疗取得一定进步，但总体预后仍不理想，其主要原因与肿瘤过度增殖和转移相关。因此，针对结直肠癌增殖与转移的治疗成为近些年来的研究热点。

四羟基二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是从中药何首中提取的一种水溶性有效成分，其结构与白藜芦醇相似，仅二位多一个酚羟基并形成了糖苷，均属于二苯乙烯类［2]。前期针对THSG在结肠癌中的治疗作用笔者开展了一定的研究。TGFβ是肿瘤细胞发生上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）最为相关的因子，在肿瘤转移过程中扮演重要角色［3]。前期笔者发现THSG通过直接抑制PI3K/AKT通路，从而抑制TGFβ诱导的EMT，提示THSG在抑制结肠癌转移中发挥着潜在的治疗作用［4]。当前研究报道白藜芦醇在人白血病、胃癌、恶性胶质瘤、结肠癌［5-8]等多种肿瘤中能抑制PI3K/AKT/NF-κB通路。而研究证实PI3K/AKT/NF-κB通路对肿瘤细胞增殖与凋亡至关重要。根据结构相似性和前期研究，笔者推测THSG有望通过抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，从而抑制结肠癌细胞增殖，促进凋亡，发挥其抗癌的药理学价值。本研究拟针对THSG对结肠癌增殖和凋亡的影响及其作用机制展开探讨，为将其开发成为抗癌药物提供理论和实验依据，以期为结肠癌的治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 细胞株人结肠癌细胞株HCT116和SW480由南方医科大学病理实验室提供。

1.2 实验试剂胎牛血清、RPMI-1640为美国GIBICO公司产品，CCK8试剂购于北京全式金生物技术有限公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，二苯乙烯苷（纯度＞98%）购于成都百科通生物，顺铂购自sigma公司，PTEN及P-AKT、AKT抗体购于Cell Signaling Technology公司，GAPDH和鼠、兔二抗均购于北京中杉金桥有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CCK8检测细胞增殖取对数生长期的HCT116和SW480细胞调整浓度为2×105/mL，每孔100μL接种于96孔板，24 h后吸去培基，分别加入5、10、20 mmol的THSG培养24、48、72 h，随后每孔加入100μL；含CCK8试剂的培养基（培养基：CCK8=9∶1）37℃培养1 h，酶标仪于490 nm处检测各孔吸光值（A）。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡操作步骤按说明书进行。HCT116和SW480在不同浓度THSG作用24 h后，PBS洗涤2次，不含EDTA胰酶消化后加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC混匀后再加入5μL PI混匀，室温避光15 min，上机检测。

1.3.3 Western blot将处于对数生长期的HCT 116和SW480细胞分别按70%～80%的密度接种于6孔板中，贴壁后加入不同浓度的THSG作用24 h后收细胞集细胞，加入RIP裂解液裂解1 h后BCA法测定蛋白浓度，加入相应体积的loading buffer 95℃变性5 min。蛋白用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿法转印至PVDF膜上，转膜结束后加入相应一抗4℃孵育过夜，次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温1 h后常规显色发光。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，进行多组间的均数比较采用单因素方差分析，分析前先通过Levene法检测方差齐性，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnett′s T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THSG对HCT116和SW480细胞增殖的影响CCK8细胞增殖实验结果显示，THSG对结直肠癌细胞HCT116和SW480增殖的抑制呈时间和剂量依赖性。当THSG浓度为5 mmol时，作用于HCT116细胞24、48和72 h细胞抑制率分别为8.2%、15.133%及22.767%；作用于SW480细胞24、48和72 h细胞抑制率分别为5.867%、11.100%及14.733%。当THSG浓度为10 mmol时，作用于HCT116细胞24、48和72 h细胞抑制率分别为23.800%、34.633%及50.967%；作用于SW480细胞24、48和72 h细胞抑制率分别为12.033%、23.200%及44.300%。当THSG浓度为20 mmol时，作用于HCT116细胞24、48和72 h细胞抑制率分别为48.633%、6.667%及85.500%；作用于SW480细胞24、48和72 h细胞抑制率分别为40.100%、58.000%及85.333%。见图1。

图1 THSG对HCT116和SW480细胞增殖的影响Fig.1 The effect of THSGon HCT116 and SW480 cells proliferation

2.2 二苯乙烯苷对顺铂化疗增敏的影响CCK8结果显示，与单纯使用顺铂相比，不同浓度的顺铂与10 mmol THSG联合作用24 h对HCT116和SW480细胞增殖抑制作用更强。当顺铂浓度为2.5μg/mL时，HCT116和SW480细胞24 h细胞抑制率分别为41.98%和36.31%，与THSG联合使用后HCT116和SW480细胞24 h抑制率分别为55.48%和57.14%，与单独使用顺铂相比差异有统计学意义（t=-6.943，P＜ 0.05；t=-7.199，P＜0.05）；当顺铂浓度为5μg/mL时，HCT116和SW480细胞24 h细胞抑制率分别为67.63%和58.26%，与THSG联合使用后HCT116和SW480细胞24 h抑制率分别为77.33%和82.00%，与单独使用顺铂相比差异有统计学意义（t=-7.147，P＜0.05；t=-11.726，P＜0.05）；当顺铂浓度为10μg/mL时，HCT116和SW480细胞24 h细胞抑制率分别为86.01%和79.34%，与THSG联合使用后HCT116和SW480细胞24 h抑制率分别为93.03%和91.70%，与单独使用顺铂相比差异有统计学意义（t=-3.880，P＜0.05；t=-14.573，P＜ 0.05），见图2。

图2 THSG与顺铂联合使用对HCT116和SW480细胞增殖的影响Fig.2 The effect of combination treatment of THSGand cisplation on HCT116 and SW480 cells proliferation

2.3 二苯乙烯苷对CRC细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，5 mmol THSG作用于HCT116和SW480细胞时，细胞早期凋亡率分别为（6.33±0.45）%和（4.63±0.25）%，10 mmol THSG作用于HCT116和SW480细胞时，细胞早期凋亡率分别为（11.8±0.56）%和（10.53±0.71）%，20 mmol THSG作用于HCT116和SW480细胞时，细胞早期凋亡率分别为（38.87±2.32）%和（40.47±1.06）%。多重结果比较表明，THSG可诱导HCT116和SW480细胞凋亡，且随THSG浓度的增加，HCT116和SW480细胞早期凋亡率也随之增加（F=562.515，P＜0.001；F=2241.404，P＜ 0.001），见图3。

2.4 二苯乙烯苷对PI3K/AKT/NF-κB通路的影响Western blot结果显示，与空白对照组相比，THSG处理组PTEN的蛋白表达随浓度的增加呈现递增趋势，而p-AKT、p-IKKβ的表达随浓度的增加呈递减趋势，提示THSG可以抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，见图4。

图3 Annexin V/PI双标法检测不同浓度THSG作用24 h对HCT116和SW480细胞凋亡的影响Fig.3 The effect of different concentration treatment of THSGon HCT116 and SW480 cells apotosis for 24 h was detected by Annexin V/PIflow cytometry

图4 THSG对HCT116和SW480细胞PI3K/AKT/NF-κB通路的影响Fig.4 The effct of THSGon PI3K/AKT/NF-κBpathway in HCT116 and SW480 cells

3 讨论

近年来，随着国民生活水平的提高，膳食结构和生活方式的改变，结直肠癌的发病率逐年上升，名列各大恶性肿瘤第5位［1]。针对早期肿瘤，手术切除是首选治疗策略，而晚期肿瘤则依赖放化疗、分子靶向治疗等综合治疗［9]。由于缺乏常规体检筛查，有近一半以上的患者确诊时已处于晚期［10]。因此，寻找和开发新的综合治疗策略，具有重大的临床意义。

中医是我国的国粹，中医药及其提取物在抗肿瘤治疗上越来越受瞩目。研究证实多种中药单体如青蒿烯［11]、姜黄素［12]、雷公藤甲素［13]等通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制肿瘤相关信号通路等机制发挥抗肿瘤效果。四羟基二苯乙烯苷（2，3，5，4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG）是中药何首乌提取物之一，与白藜芦醇存在结构相似性［2]。而白藜芦醇已被证实通过抗氧化作用和干扰肿瘤相关信号传导如PI3K/AKT通路、NF-κB通通、mTOR通路、MAPK通路、Hedgehog（Hh）通路等发挥重要的抗癌抑癌的作用［5-8，14]。基于结构相似性，笔者推测THSG可能也发挥着潜在抗癌价值。在前期研究中，笔者也证实THSG通过抑制PI3K/AKT通路，拮抗TGFβ诱导的结肠癌细胞EMT，从而抑制结肠癌转移［4]。回顾THSG相关研究，LIU等［15]报道THSG的酚羟基通过给出氢原子，自身形成二聚体，从而清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基，进而发挥抗氧化作用。小鼠心肌细胞中，THSG则拮抗阿霉素诱导的丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的产生，改善化疗药物的心脏毒性［16]。心脑血管方面，THSG抑制炎性因子如CRP、IL-6、TNFα等产生，进而改善动脉粥样硬化［17]。在其他肿瘤领域，THSG也被证实发挥抗肿瘤功能。乳腺癌中，THSG抑制MCF-7细胞PI3K/AKT通路，从而抑制细胞增殖［18]；黑色素瘤B16细胞中，THSG则抑制MAPK通路，抑制细胞增殖［19]。结合THSG分子结构分析、前期相关研究基础和国内外文献报道，笔者有理由相信THSG在结肠癌治疗中发挥着潜在抗癌作用，本研究拟探究THSG在结肠癌中的生物学功能及其相关分子机制，为将来临床应用提供理论支持和实验依据。

通过对结直肠癌细胞HCT116和SW480给予THSG处理，肿瘤细胞呈现增殖抑制，并呈现浓度和时间依赖性，该研究结果与乳腺癌［18]和黑色素瘤［19]中的研究报道相符，进一步证实THSG的抗癌作用。有研究报道白藜芦醇在膀胱癌中可增加顺铂化疗敏感性［20]，基于结构相似性，本研究接下来探索THSG是否能增加结直肠癌细胞顺铂化疗的敏感性。通过CCK-8和流式细胞仪技术，本研究均证实较单用顺铂化疗组，THSG联合顺铂组的细胞抑制率更高，化疗诱导的细胞凋亡率也明显增加，该实验结果首次说明THSG不但抑制结直肠癌细胞HCT116和SW480的增殖，而且可增加顺铂化疗敏感性，是一种良好的化疗辅助药物，具有较大的临床治疗价值，但THSG介导增殖抑制和化疗敏感性的潜在分子机制仍不清楚。白藜芦醇在多种恶性肿瘤中可通过抑制PI3K/AKT/NF-κB通路抑制从而抑制癌细胞增殖，发挥其抗癌作用，同时，研究发现乳腺癌中THSG可抑制PI3K/AKT通路［18]，前期研究笔者进一步确认了THSG在肠癌中针对PI3K/AKT通路的抑制作用［4]。文献报道THSG在结肠癌HT-29细胞中通过抑制NF-κB通路来抑制肿瘤转移［21]，而NF-κB通路是PI3K/AKT通路的下游之一。PI3K/AKT/NF-κB通路是经典的肿瘤相关信号通路，PTEN的缺失导致PI3K/AKT通路的活化，磷酸化的AKT促进IKKα和IKKβ磷酸化，激活NF-κB入核，参与调控细胞增殖、EMT、肿瘤发展、化疗耐药等多个生物学功能［22]。因此笔者推测THSG可能在结直肠癌中通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号轴，发挥抑癌功能。Western blot发现随着THSG刺激浓度的增加，HCT116和SW480细胞中PTEN的水平逐渐升高，AKT的蛋白磷酸化水平则递减，同时IKKβ的磷酸化水平也受到抑制，说明THSG抑制了结直肠癌细胞中的PI3K/AKT/NF-κB信号通路。

综上，本研究首次探讨了何首乌提取物THSG对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响，本研究首次证实THSG抑制结直肠癌细胞的增殖，且增加顺铂的化疗敏感性，其潜在的分子机制可能与其诱导PTEN蛋白的表达，抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关。笔者的研究为将来应用THSG抗肿瘤和辅助化疗用药提供了有力的理论和实验依据。本研究除了以上发现，仍存在不足的地方。虽然多种肿瘤中均证实了THSG的抗癌效果，本研究也在肠癌中针对肿瘤增殖和转移开展了一系列相关研究并取得了一定的阳性结果，但目前THSG作用的直接药理学靶点仍未被发现，THSG的抗癌作用也缺乏体内实验的进一步验证，其调控的其他肿瘤相关信号通路如MAPK、mTOR Hedgehog（Hh）等也缺乏进一步论证。后续工作中，笔者将综合高通量手段，筛选THSG相关的作用靶点，构建THSG抗癌分子网络，明确THSG的确切分子机制，为其将来的临床应用提供可靠依据。