右美托咪定对脂多糖大鼠肺组织NF-κB表达的影响

雷贤英 甘辞海 伍长学 王丽 高晓岚 胡丽蓉 薛钰婷 文成丽

西南医科大学附属医院ICU（四川泸州 646000）

脓毒症（sepsis）是各种感染导致的全身炎症反应综合征，是常见的感染性疾病引起的危重症，病死率极高［1]。脓毒症的发病是多因素综合作用的结果，当机体遭受病原体感染时，机体炎症效应细胞表面的受体与病原体表面的抗原结合，通过抗原、抗体反应和酶的活化途径，激活细胞内转录因子（核因子NF-κB），最终诱导多种促炎因子以及炎性介质的生成和释放，导致脓毒症的发生［2]。有研究表明，右美托咪定具有显著的器官保护作用［3]。该实验以右美托咪定进行干预，研究其对早期脓毒症大鼠大量炎症反应的调控点NF-κB蛋白在肺组织中表达的影响，探讨右美托咪定在脓毒症救治中的作用机制，为脓毒症的治疗寻找新途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物成年健康雄性Wistar大鼠共40只（西南医科大学SPF实验动物中心提供，动物实验使用合格证号：SYXK（川）2013-065），体质量200～250 g。均饲养在SPF级环境中，室温20～24℃，相对湿度40%～70%。饲喂全价颗粒料，自由进食和饮水。实验前均禁食6 h，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 复制模型及药物处理运用随机数字表法将40只大鼠分为5组（n=8），分别为对照组（生理盐水组）、脓毒症组（LPS）、右美托咪定低剂量组（D+L）、右美托咪定中剂量组（D+M）、右美托咪定高剂量组（D+H）。采用22号留置针经清醒大鼠尾静脉穿刺置留置针行尾静脉保留置管，肝素水封管，用丝线固定以备给药。对照组：1 mL/kg注射0.9%生理盐水；LPS组：以5 mg/kg注射脂多糖复制脓毒症大鼠模型（要求10 min以上注射完）；右美托咪定高/中/低剂量组：在5 mg/kg注射脂多糖建模成功后，随即泵注负荷剂量右美托咪定（6.5μg/kg，要求10 min以上泵完），然后分别按照4.5、1.5和0.5μg/（kg·h）的速度持续泵入右美托咪定，泵注6 h后用1%戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，取肺组织备用。

1.2.2 标本采集40只大鼠均在6 h后用1%戊巴比妥钠静脉注射麻醉处死，在无菌条件下取下部分肺组织，进行免疫组织化学和免疫印迹法行NF-κB相关分析，并在显微镜下观察肺组织显微结构的改变。

1.2.3 检测指标和方法

1.2.3.1 免疫组化法实验步骤（1）将肺组织切片进行HE染色以及显微结构的观察：所有标本经过40 g/L甲醛溶液固定，梯度脱水及浸蜡，包埋，5μm连续切片后烤干、再经脱蜡、HE染色、透明和封片；（2）肺组织NF-κB蛋白表达：制备肺组织切片（片厚3μm）。采用二步法进行免疫组织化学染色，染色按照试剂盒说明书上的步骤进行操作，肺组织切片进行常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水后微波热修复抗原，再用3%过氧化氢灭活内源性酶，封闭血清，滴加一抗（稀释度为1∶300）后4℃过夜，再滴加二抗，DAB显色，镜下控制反应时间，以阳性产物棕黄色为度，苏木素进行复染，脱水明中性树脂封片，用显微镜观察照相。每一标本随机选取1张切片，在高倍镜（×200）下随机地选择5个视野，使用Image-Pro Plus 6.0软件分析并计算阳性区平均光密度值（MOD）。MOD=积分光密度值（integrated optical density，IOD）/面积，所得数据取均值后分析统计。

按SP试剂盒说明书进行操作，观察细胞浆颜色，细胞浆被染成棕黄色的为表达阳性，在每张切片上计数200个细胞，然后计算阳性细胞所占比值（A）。计算方法：阳性率（A%）=阳性细胞数/200×100%，每组观察5张切片，重复进行5次，得到的数据取均值后进行统计分析。

1.2.3.2 免疫印迹法实验步骤把碾磨的肺组织粉末加入冰预冷的RIRA裂解液中提取总蛋白，用Bradford法进行定量，按照每孔20μg上样量进行SDS-PAGE（分离胶浓度：10%，浓缩胶浓度：5%），经湿转膜后加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，弃去封闭液，加入含2%脱脂奶粉的TBST稀释一抗NF-κB p65或β-actin，置于4℃下振荡孵育过夜；经TBST洗涤后，再与HRP标记羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）进行室温振摇孵育2 h，再经TBST洗涤后，加入ECL发光显示液于全自动凝胶成像分析仪上进行曝光，得到的图像用Gel-Pro analyzer4.0软件进行条带灰度分析后计算出目的蛋白与β-actin灰度比值。

1.3 统计学方法所有结果都以均数±标准差表示，所有数据都采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。不同组间采用单因素方差分析进行比较，若组间差异存在着显著性，进一步采用Student-Newman-Keuls法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织HE染色与免疫组化检测NF-κB表达情况将肺组织进行HE染色和免疫组化染色后光镜下观察。对照组：未见AGEs阳性细胞（图1①），肺泡壁薄，支气管和肺泡上内皮细胞结构均完整，未见炎性细胞浸润（图1②）。LPS组：见大量的AGEs阳性细胞（图1③），支气管和肺泡上内皮细胞结构均紊乱，肺泡壁增厚，肺泡壁和肺间质可见大量炎性细胞浸润，伴明显充血水肿和片状出血坏死灶（图1④）。低剂量、中剂量组：见较多AGEs阳性细胞（图1⑤，⑦），肺泡壁有轻度增厚，部分肺泡内可见出血、水肿，少量炎性细胞和红细胞浸润（图1⑥，⑧）。高剂量组：见少量AGEs阳性细胞（图1⑨），支气管和肺泡上内皮细胞结构较完整，肺泡壁和肺间质轻度增厚，少量炎性细胞和红细胞浸润（图1⑩）。

图1 肺组织HE染色与免疫组化检测NF-κB表达（×100）Fig.1 The expression of NF-κB by HE staining and immunohistochemistry

2.2 免疫组织化学检测肺组织NF-κB蛋白量表达脓毒症组（LPS组）NF-κB蛋白的表达明显，右美托咪定高剂量组（D+H组）NF-κB蛋白的表达减少。经统计学分析，LPS组肺组织平均光密度（MOD）值与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。D+H组肺组织MOD值与LPS组比较明显减少，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（表1）。LPS组肺组织阳性细胞所占值（A%）与对照组组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。高剂量组（D+H组）肺组织的阳性细胞所占值（A%）与LPS组比较明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 2）。

2.3 免疫印迹法检测肺组织NF-κB蛋白表达情况如图2，β-actin片段的大小趋于一致，均清晰且无杂带。各组蛋白都有较强的actin条带出现，表明每组样品的蛋白总浓度相近，并且各组actin条带的亮度相似。在实验组中，LPS组的NF-κB条带明显增强，各治疗组中，D+H组条带亮度稍弱，D+M/D+L治疗组NF-κB条带亮度变化不明显。

表1 肺组织NF-κB蛋白的表达平均光密度（MOD）值Tab.1 The mean optical density（MOD）of NF-κB protein in lung tissue ±s

表1 肺组织NF-κB蛋白的表达平均光密度（MOD）值Tab.1 The mean optical density（MOD）of NF-κB protein in lung tissue ±s

注：与对照组比较，*P=0.001；与LPS组比较，△P=0.014

分组 样本量 视野/切片MOD对照组LPS组D+L组D+M组D+H组8 8 8 8 8 60/8 60/8 60/8 60/8 60/8 0.048 8±0.008 8 0.072 0±0.008 4*0.066 0±0.008 9 0.064 0±0.008 9 0.056 0±0.011 4△

表2 各组肺组织NF-κB蛋白的表达（A%）Tab.2 Theexpression of NF-κBprotein in lungtissue ±s

表2 各组肺组织NF-κB蛋白的表达（A%）Tab.2 Theexpression of NF-κBprotein in lungtissue ±s

注：与对照组比较，a P=0.004；与LPS组比较，b P=0.027

分组 样本量 视野/切片A%对照组LPS组D+L组D+M组D+H组8 8 8 8 8 60/8 60/8 60/8 60/8 60/8 25.274 0±5.774 1 36.488 0±5.559 4a 30.196 0±4.851 8 30.572 0±5.486 0 28.175 0±5.860 3b

图2 Western blot检测肺组织NF-κB结果Fig.2 The results of NF-κB in lung tissue by Western blot

3 讨论

在机体受到病原体感染时，机体炎症效应细胞表面受体识别病原体表面的抗原，再通过一系列抗原、抗体反应及酶的活化途径，进而激活细胞内转录因子（如NF-κB），最终诱导炎性介质及多种促炎因子的生成和释放［4]。这些炎性介质和促炎因子通过正反馈形式形成引发瀑布效应和细胞因子风暴，级联扩大机体炎症反应，从而导致脓毒症的发生［5]。

急性肺损伤是引起脓毒症患者死亡的最重要原因之一，其发生时间最早，发生率最高［6]。

肺组织的炎症高反应性被认为是脓毒症时病理生理反应的组成部分之一，其中引起促炎因子上调和炎性细胞浸润是脓毒症发病机制的关键所在［7]。有实验研究发现，在创伤性休克所致的急性肺损伤动物模型中，组织或细胞NF-κB活性明显增强，血液和肺泡灌洗液中的炎症介质如IL-6、TNF-α等的含量明显增加，实验结果显示，严重脓毒症时，通过激活NF-κB，进而启动TNF-α等炎性因子的大量释放，最终导致严重脓毒症血清干预离体培养肺血管内皮细胞的损伤［8]。

右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）与阿片类药物的不同之处是其基本不会引起呼吸抑制，主要通过作用于脑组织蓝斑核中的α2受体，参与镇静、催眠和呼吸的调节［9]。有观察显示，给予正常志愿者DEX后，其呼吸类似于自然睡眠呼吸状态，而给予进行人工辅助呼吸的患者DEX后，其高碳酸血症的发生率明显降低，可维持良好的每分钟通气量，其呼吸抑制阈值和呼吸暂停次数也明显降低［10]。GEZE等［11]的研究显示，在气腹前预给DEX可明显减少中性粒细胞浸润及肺组织缺血修饰性白蛋白的产生，从而减轻因气腹引起的肺损伤；而使用高剂量DEX后能明显改善高潮气量通气模式（HVT）所致呼吸机相关性肺损伤的肺炎症反应，从而减轻肺水肿发生［12]。GU等［13]的实验研究显示，DEX可通过激活α2受体依赖和非依赖双重机制减轻肾缺血-再灌注损伤所致的远端肺损伤。另有研究将氯胺酮和DEX联合应用于失血性休克大鼠模型中，其结果显示，急性肺损伤的发生率明显减少，呼吸机相关性肺损伤的发生率及严重程度明显下降，具有明显的肺保护作用［14]。

基于右美托咪定的抗炎和肺保护效应，本研究通过免疫组化法对肺组织NF-κB蛋白进行检测显示：与脓毒症组比较，高剂量DEX组肺组织NF-κB蛋白平均光密度（MOD）值明显下降（P=0.014），该组肺组织NF-κB蛋白表达量明显减少（P=0.027）；通过免疫印迹法亦显示高剂量DEX组肺组织NF-κB蛋白表达条带明显减弱；光镜下高剂量DEX组可见支气管和肺泡上内皮细胞结构较完整，肺泡壁和肺间质轻度增厚，少量炎性细胞和红细胞浸润。用中、低剂量右美托咪定干预处理后，肺组织NF-κB蛋白表达量有一定程度的下降，但变化不明显（P＞0.05）。这一系列的实验结论均证实，高剂量DEX可干预早期脓毒症大鼠大量炎症反应的调控点NF-κB蛋白的表达，高剂量DEX对脓毒症大鼠急性肺损伤有明显的保护作用。

因此，高治疗剂量4.5μg/（kg·h）的右美托咪定可减少早期脓毒症大鼠肺组织NF-κB蛋白的表达量，进而抑制下游炎症因子的释放，缓解肺损伤，具有肺保护的作用。