RIP1/RIP3通路在大鼠急性脑梗死中的作用

钟春荣 符传艺 杨杰

1中南大学湘雅医院神经内科（长沙 410008）；海南省人民医院2保健中心四区，3神经外科（海口 570311）

急性脑梗死（acute cerebral infarction）常见于脑血栓形成及脑动脉粥样硬化等原因，引发脑血管狭窄，血流减少，严重者脑血管闭塞，进而出现局灶性脑缺血，引起相应支配区域的脑组织坏死［1-2]。急性脑梗死具有高致残率、高病死率及高复发率特点，神经挽救及功能康复不甚理想，因此，研究并阐释急性脑梗死神经元死亡的病理生理过程及其调控是治疗的关键点。神经元死亡包括自噬、程序性坏死及凋亡等方式，随着研究深入，发现程序性坏死在急性脑梗死中扮演着重要的角色［1]。另外研究表明，RIPs是受体相互作用蛋白（receptor interacting proteins），其活化可参与调控细胞程序性坏死，抑制其产生炎症反应，尤其是RIP1/RIP3通路发挥着关键作用［3-4]。因此，本课题组通过制作大鼠急性脑梗死模型，研究RIP1/RIP3表达及其对炎症反应的影响，探讨程序性坏死信号通路RIP1/RIP3在急性脑梗死中发挥作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g，平均（180±20）g（由中南大学实验动物中心提供）。大鼠饲养于SPF级清洁动物培养室，温度22～25℃，相对湿度40%～60%，12 h/12 h日夜光照条件下饲养。

1.2 试剂与仪器羊抗鼠RIP1一抗和羊抗鼠RIP3一抗、HRP标记兔抗羊二抗（武汉博士德生物有限公司），Western blot相关试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）ELISA试剂盒（美国R&D公司），Nec-1（美国Alexis生物技术公司），酶标仪（美国BD公司）等。

1.3 方法

1.3.1 动物分组将36只Wistar大鼠正常适应性饲养2周后随机分为3组，每组12只，分别为急性脑梗死组（采用大脑中动脉阻滞法建立急性脑梗死大鼠模型）、对照组（对照组手术步骤同急性脑梗死组，但不插入线栓）和5-（1H-吲哚-3-基甲基）-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮（Nec-1）组（在急性脑梗死模型建立后，按0.6 mg/kg腹腔注射RIP1特异性抑制剂Nec-1溶液［2]，连续注射7 d）。所有大鼠均在7 d后断头取脑组织。

1.3.2 急性脑梗死模型的建立采用改良Longa线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞急性脑缺血模型，采用10%水合氯醛按照6 mL/kg对大鼠进行腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，依次切开右侧颈部皮肤，肌肉，暴露颈总动脉，于CCA分叉处近心侧做一切口，插入前端蘸有石蜡的3-0单股尼龙缝线，短暂夹闭翼腭动脉（PPA）以防误插，栓线经ICA入颅，插入深度约为20 mm，至大脑前动脉近端，完全阻断大脑中动脉起始部的血供。采用Zea longa 5分制评分法评估［5]，如出现行走时身体向偏瘫侧，并转圈体征为造模成功。

1.3.3 Western blot检测海马组织RIP1和RIP3表达提取各组大鼠右侧海马组织：加裂解液，在冰上裂解细胞15～30 min，5 s×4次超声破碎细胞，4℃、10 000×g离心15 min，转移上清至新的Ep管中，蛋白定量后于-20℃保存，用于Western blot实验。分离蛋白采用10%SDS-PAGE电泳，并将胶用半干转膜法转移至PVDF膜，去除非特异性背景采用室温，5%脱脂奶粉作用，2 h。分别加入一抗1∶1 000，1∶1 500稀释的RIP1和RIP3单抗，摇床，4℃，过夜，PBST洗涤，室温，避光条件下加入1∶2 000兔抗羊二抗，孵育30 min，PBST洗涤，化学发光剂显色1 min，X线片曝光成像，观察结果。采用蛋白图像处理系统软件和Quantity one软件分别扫描X线胶片和条带密度测定。分别重复实验4次。

1.3.4 ELISA法检测各组大鼠海马中TNF-α、IL-6表达提取各组大鼠的海马脑组织准确称取，加9倍的4℃生理盐水，经研磨搅拌制成10%的组织匀浆，匀浆完毕冰上静置30 min以利蛋白充分裂解，制得的匀浆液在4℃，12 000 r/min离心15 min×2次，取上清液。实验操作步骤按照ELISA试剂盒说明进行。主要操作步骤包括：取出96孔板，加50μL依次稀释的标准品于相应的反应孔中，制备标准曲线。加50μL待检样品于反应孔中。每个样品做3个复孔。以空白孔调零，在450 nm波长下应用酶标仪测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15 min以内进行。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.4 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数的比较应用单因素方差分析。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIP1在急性脑梗死大鼠海马中的表达与对照组比较，急性脑梗死组海马组织中RIP1表达增加（P＜0.05）；Nec-1可降低急性脑梗死组RIP1表达，与急性脑梗死组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 RIP3在各组大鼠海马中的表达与对照组比较，急性脑梗死组中海马组织RIP3表达增加（P＜0.05）；Nec-1可降低急性脑梗死组海马RIP3表达，与急性脑梗死组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 各组大鼠海马中TNF-α和IL-6表达改变与对照组比较，急性脑梗死组中海马中炎症因子TNF-α、IL-6表达增加（P＜0.05）；Nec-1可抑制TNF-α、IL-6表达，与急性脑梗死组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

图1 RIP1在各组大鼠海马中的表达Fig.1 Expression of RIP1 in hippocampus of rats in each group

程序性坏死最早由DEGTEREV等［6]发现并命名，是一种有别于坏死但类似细胞凋亡，是可调控的细胞死亡方式，其有ATP含量下降、线粒体水肿破裂、自由基和胞内钙升高以及炎症因子浸润等坏死样特征，但需要特定的启动因子促发及调控，其又有凋亡特点。研究发现急性脑梗死可能存在自噬、程序性坏死及凋亡等病理过程［3，7-8]。另外研究表明，RIP1/RIP3是程序性坏死关键的调控节点，其广泛存在于神经元中［4]，在死亡信号TNF等刺激下可通过自体磷酸化，促进程序性细胞死亡发生［9-11]，RIP1/RIP3表达水平与细胞程序性坏死呈正相关。急性脑梗死TNF-α、IL-6等炎性因子高表达，表现为非感染性炎症［12]，RIP1/RIP3在中枢神经组织放射性损害及血管痉挛缺血后神经组织炎性反应中起着关键调控作用［2，13]，因此，笔者推测RIP1/RIP3可能在急性脑梗死中出现高表达，程序性坏死可能是急性脑梗死重要病理过程，并扮演着重要作用。但RIP1/RIP3信号通路在急性脑梗死中的表达和作用尚未见报道。

本研究通过阻断大脑中动脉制作大鼠急性脑梗死模型，检测缺血后患侧海马组织中RIP1和RIP3表达，并以海马TNF-α、IL-6的表达水平作为脑缺血后炎症应答的指标，判断急性脑梗死中神经元程序性坏死与炎症程度的伴随关系。LIU等［10]研究表明TNF-α诱发大鼠大脑海马神经元程序性坏死。急性脑梗死发生后，脑组织缺血后产生大量炎性因子诸如TNF-α与IL-6，引发剧烈的炎症反应，进一步损害脑组织［11]。在本研究中，急性脑缺血大鼠脑梗死侧海马区神经元大量坏死，该区域RIP1/RIP3表达显著增加，证实了程序性坏死是缺血后神经元死亡的重要方式，伴随着神经元坏死，生成大量自由基及炎症因子［14-15]，周围产生炎性改变。对照组未见TNF-α、IL-6水平升高，程序性坏死与炎症严重程度正相关，急性脑缺血后神经元有氧呼吸链中断，产生大量氧自由基及炎性因子，TNF-α、IL-6是程序性坏死外源性启动因子，激活RIP1/RIP3信号通道，促发程序性坏死。

SU等［16]研究揭示RIP1拮抗剂Nec-1在大鼠脑室出血模型中有保护作用，研究中发现Nec-1能够减轻脑组织水肿，抑制炎性因子诸如IL-6、TNF-α产生，且改善大鼠全脑缺血再灌注损伤后的认知和行为能力［17]。本研究中大鼠缺血后经Nec-1处理后，RIP1/RIP3表达水平明显下降，程序性坏死显著减轻，伴随之是TNF-α和IL-6血液中水平下降。因此，笔者认为Nec-1能够通过阻断RIP1/RIP3通路，抑制炎症反应，从而减轻急性脑缺血后神经元程序性坏死，其与出血后神经保护机制有共同的路径，进一步证实了RIP1/RIP3通路与急性脑梗死的密切关系。

综上所述，RIP1/RIP3通路参与调控急性脑梗死神经元程序性坏死过程，本研究为急性脑梗死机制和治疗的研究提供新的依据和靶点。Nec-1可通过调控RIP1/RIP3通路，抑制炎症，从而减少神经元程序性坏死。但Nec-1是否同时减轻非程序性坏死或凋亡，尚需要下一步研究证实。