miRNA-21、miRNA-34a在宫颈癌、CIN、正常组织中的差异性表达及对宫颈癌早期诊断价值

周玉飞 岳青芬

郑州大学附属洛阳中心医院妇科（河南洛阳 471000）

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，随着我国社会经济的发展、人们性观念、生活习惯的改变，近年来发病年龄呈年轻化趋势［1-2]。组织活检、宫颈刮片细胞学检查是诊断宫颈癌较为准确的方法，但在实际中难以用于高危患者的大规模筛查。同时，部分患者在首次就诊时，因组织活检等检查的有创性，依从性较低，因此，寻找经济、快捷、简便的诊断及预后判断方法仍然是临床工作的难点［3]。miRNA是一类非编码单链RNA分子，广泛参与肿瘤细胞的增殖、浸润、迁移等过程，可发挥类癌基因或抑癌基因作用［4-5]。在胃癌［6]、结肠癌［7]、胰腺癌［8]等恶性肿瘤中均发现了多种差异性表达的miRNA。miRNA-21、miRNA-34a是较早发现的人类miRNAs［9]，参与了多种肿瘤的发生发展，但在宫颈癌中的研究较少。因此，本研究检测了不同类型患者组织及血清中二者的表达差异，分析其临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2017年1-8月我院收治的宫颈癌、CIN、子宫肌瘤患者为研究对象，分为：（1）对照组：因子宫肌瘤行手术治疗的31例患者；（2）CIN L组：低级别上皮内瘤变Ⅰ级的31例患者；（3）CIN H组：高级别上皮内瘤变Ⅱ级、Ⅲ级的28例患者；（4）宫颈癌组：因宫颈癌行手术治疗，且无宫颈相关病变的42例患者。纳入标准：（1）诊断均经病理学或细胞学证据确认；（2）均行手术治疗；（3）术前未行放化疗；（4）临床资料完整；（5）知情同意。排除标准：（1）同时合并有其他系统的恶性肿瘤；（2）合并有其他重要系统的严重疾病或免疫性疾病。

1.2 标本与试剂规范化收集新鲜手术切除标本，切成大小适宜的组织块，在标本离体后30 min内置于冻存管，在-70℃条件下保存。在术前2 d抽取患者血液标本，离心后取血清，置于EP管内，加入裂解酶，充分震荡后冻存。miRNA逆转录试剂盒、PCR Master Mix、DNA Marker、Protein Marker均购于Takara公司（大连）。PCR引物、DEPC购于博士德生物工程有限公司（武汉）。

1.3 实验方法（1）组织中总RNA提取：标本装入EP管，滴加Trizol试剂，匀碎后静置5 min。加入氯仿0.2 mL后震荡，静置10 min。4℃，12 000 r/min，离心15 min后管内液体分为上中下三层，吸取上层水相至EP管，加入异丙醇，混匀后静置15 min。再次离心15 min，弃上清，取管底白色沉淀，加入冰乙醇1 mL，混匀后离心，弃上清，重复操作后，保留沉淀，静置30 min。加入DEPC水约20～30μL至完全溶解。采用分光光度计计算RNA纯度及浓度。取1μg总RNA，电压100 V，电泳30 min。提取的总RNA，-80℃条件下保存。（2）逆转录反应：参照miRNA反转录试剂盒说明书进行。将反应体系混匀后，瞬时离心，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，所得cDNA置于-80℃下保存。（3）RT-PCR检测：以cDNA为模板，严格按照荧光定量试剂盒说明书进行操作。反应体系包括：cDNA 1 μL、2×PCRMaster Mix 10μL、Forward primer 1μL、Reverse primer 1μL、10×SYBER Green 0.5 μL、ddH2O 6.5 μL。反应条件为，Stage1：95 ℃ 10 min；Stage2（40 cycle）：95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s。（4）PCR产物相对定量检测：以U6为内参对目标基因进行归一化处理，采用公式RQ=2-△△CT计算表达量倍数的变化（RQ：相对表达量，C：cycles，T：threshold）。

1.4 统计学方法所有数据均采用SPSS 20.0软件包进行。描述性分析采用频数、率±s，统计推断采用独立样本t检验、方差分析、卡方检验。采用受试工作者特征曲线（ROC）评价miRNA-21、miRNA-34a对宫颈癌的诊断效能。相关性分析采用Pearson分析。检验水准α=0.05。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测组织表标本中miRNA-21、miRNA-34a结果miRNA-21、miRNA-34a的扩增曲线平滑，呈标准S型。溶解曲线表现为单峰，无其他杂峰信号。表明实验过程中未出现非特异性扩增、污染或引物二聚体，检测结果可靠。见图1。

图1 miRNA-21、miRNA-34a扩增曲线（a）、溶解曲线（b）Fig.1 miRNA-21、miRNA-34a amplification curve（a）and dissolution curve（b）

2.2 miRNA-21、miRNA-34a在组织中的表达水平对照组、CIN L组、CIN H组、宫颈癌组组织中miRNA-21表达水平的 2-△△CT值分别为（1.12 ±0.46）、（1.22 ± 0.52）、（1.44 ± 0.72）、（5.64 ± 1.57）；miRNA-34表达水平的 2-△△CT值分别为（0.91 ±0.23）、（0.85 ± 0.28）、（0.53 ± 0.30）、（0.22 ± 0.21）。宫颈癌患者组织组中miRNA-21表达水平显著高于其他3组，miRNA-34a表达水平显著低于其他3组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图2 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）在组织中的表达水平Fig.2 The expression level of miRNA-21（a）and miRNA-34a（b）in tissues

2.3 宫颈癌组织中miRNA-21、miRNA-34a表达水平与临床病理特征关系单因素分析结果显示，miRNA-21在宫颈癌组织中的表达水平与临床分期、是否存在淋巴结转移相关（P＜0.05），进一步行多因素Logistic回归分析发现，临床分期、是否存在淋巴结转移均是影响miRNA-21表达水平的独立性危险因素。miRNA-34a在宫颈癌组织中的表达水平对各临床病理参数无明显影响。见表1、2。

2.4 miRNA-21、miRNA-34a在血清中的表达水平对照组、CIN L组、CIN H组、宫颈癌组患者血清miRNA-21表达水平的2-△△CT值分别为（0.95 ±0.36）、（0.93 ± 0.32）、（1.18 ± 0.67）、（3.06 ± 1.86）；miRNA-34表达水平的2-△△CT值分别为（0.97 ± 0.22）、（0.91 ± 0.26）、（0.59 ± 0.29）、（0.35 ± 0.26）。宫颈癌组患者血清中miRNA-21表达水平显著高于其他3组，miRNA-34a表达水平显著低于其他3组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

表1 宫颈癌组织中miRNA-21、miRNA-34a表达水平与临床病理特征的单因素分析Tab.1 Univariate analysis of miRNA-21，miRNA-34a expression and clinicopathological features in cervical cancer tissues

表2 宫颈癌组织中miRNA-21、miRNA-34a表达水平与临床病理特征的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of miRNA-21，miRNA-34a expression and clinicopathological features in cervical cancer tissues

2.5 miRNA-21、miRNA-34a在组织及血清中表达水平的相关性miRNA-21在组织及血清中的表达呈显著正相关关系（r=0.763，P＜0.01）；miRNA-34a在组织及血清中的表达也呈显著正相关关系（r=0.908，P＜0.01）。见图4。

2.6 血清miRNA-21、miRNA-34a对宫颈癌的诊断效能达最佳临界点时，miRNA-21对宫颈癌诊断的敏感性为87.9%、特异性为78.8%，曲线下面积（AUC）为0.885；miRNA-34a对宫颈癌诊断的敏感性为92.8%、特异性为64.8%，曲线下面积（AUC）为0.870。见图5。

图3 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）在组织中的表达水平Fig.3 The expression level of miRNA-21（a）and miRNA-34a（b）in tissues

图4 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）在组织及血清中表达水平散点图Fig.4 Scatter plot of expression levels of miRNA-21 and miRNA-34a in tissues and serum

3 讨论

图5 miRNA-21（a）、miRNA-34a（b）对宫颈癌诊断效能的ROC曲线Fig.5 ROCcurve of miRNA-21（a）and miRNA-34a（b）for diagnosis of cervical cancer

目前，人类已知1 000多种miRNA，虽然仅占人类基因组的不到3%，但超过30%的人类基因可能被miRNA调节［10]。miRNA参与肿瘤进展的可能的机制包括［11]：（1）异常激活癌基因。（2）沉默抑癌基因。（3）诱导肿瘤血管生成。（4）增强肿瘤侵袭力。（5）调控凋亡基因。与其他选择性较强的miRNA相比，miRNA-21的最大特点在于表达部位广泛［12]。大多数研究均认为miRNA-21在恶性肿瘤中表达水平上调，但也有研究认为，miRNA-21可发挥抑癌基因作用［13]。在本研究中，宫颈癌患者组织及血清中miRNA-21表达水平显著高于其他组。这表明，miRNA-21在宫颈癌组织中呈显著升高趋势，且与临床分期、是否存在淋巴结转移密切相关。miRNA-21主要通过参与调控细胞周期及细胞凋亡作用参与肿瘤进展，在不同类型肿瘤细胞中，作用机制可能有所不同。但在宫颈癌中，miRNA-21表达水平升高可使肿瘤恶性特征更为显著，可作为判断患者预后的一个潜在因子。miR-34a是已发现的最具有肿瘤抑制性miRNA，在许多实体肿瘤，如非小细胞肺癌［14]、膀胱癌中［15]均表达下调，因此也被认为是最具潜力的调控宫颈癌细胞增殖、凋亡的新靶点。在本研究中，患者组织、血清中miR-34a表达水平均显著低于其他组，但患者临床病理参数无明显影响。这表明，随着正常宫颈上皮组织逐渐向上皮内瘤变、癌症方向转化，其表达水平逐渐下降，这提示miRNA-34a可能具有抑癌基因作用，但这种抑癌作用机制尚不明确。不同于miRNA-21的是，miRNA-34a对患者临床病理特征无明显影响，笔者推测可能的原因有：（1）miRNA-34a对宫颈癌进展的抑制作用弱于其他恶性因素的促进作用。因此，实际临床中难以体现miRNA-34a的保护作用；（2）miRNA-34a表达水平较低，数据不易显示出统计学意义。

miRNA-21、miRNA-34a在组织和血清中呈现相关性表达，这是将二者用于临床诊断的前提条件。在此基础上，笔者采用ROC曲线评价二者对宫颈癌的诊断效能。结果发现，miRNA-21、miRNA-34a对宫颈癌诊断的敏感性为87.9%、92.8%，特异性为78.8%、64.8%，这表明二者对宫颈癌均具有一定的诊断价值。定期妇科检查、血清肿瘤标志物检测、宫颈细胞学检测、阴道镜检查等是宫颈癌治疗后随访的主要措施。但实际操作中，存在耗时长、程序繁琐、费用高、患者依从性差等问题。随着血清miRNAs检测的逐渐兴起，采血后，根据血清miRNA水平随访评价患者体内肿瘤负荷，为患者的术后随访提供了新的途径。但在目前的研究阶段，笔者仅仅能肯定血清miRNA水平对判断患者预后有一定作用，但由于缺少对血清miRNA半衰期、水平变化规律及影响因素等诸多方面的系统性研究，真正将miRNA用于临床筛查、诊断及随访仍有许多问题需要解决。

综上所述，本研究发现，miRNA-21在宫颈癌组织中及血清中表达水平明显升高、miRNA-34a明显降低，在肿瘤组织及血清中的表达水平均呈正相关关系，提示miRNA-21、miRNA-34a参与了宫颈癌的发生发展过程，且二者对宫颈癌的诊断有一定的预测效能。但本研究样本量较小，随访时间较短，尚不能进一步说明miRNA-21、miRNA-34a表达水平与患者预后及复发的关系，未来在更大样本量，更长随访时间的基础上进行多中心研究，或能得到更有价值的临床结论。