线粒体转录因子A与冠心病的相关性

严亚琪 李硕 董文超 刘超 王鹏飞 侯维娜 侯瑞田 丁振江 王瑞鹃

承德医学院附属医院心脏内科（河北承德 067000）

冠心病（coronary heart disease，CHD）一直被认为是世界范围内的主要死亡原因，在过去的几十年中，有效的诊断方法能减少其对全球公共卫生的负担［1]。但在中国这样的发展中国家仍有上升的趋势。冠心病的病理基础多为冠状动脉粥样硬化。mtDNA的损伤可以导致线粒体功能障碍，促进炎症及细胞凋亡，这些皆可推动动脉粥样硬化的进程；因此mtDNA的损伤可能与动脉粥样硬化有关［2-3]。外周血线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）通过包裹mtDNA形成类似组蛋白的核样结构［4]，维护其完整和稳定，使其免受氧化应激（ROS）损伤［5]；同时通过促进mtDNA的复制来调节其拷贝数，这是TFAM保护线粒体功能的基础［6]。KRISH等［7]证明了过表达的TFAM可防止糖尿病DRG神经元中的mtDNA拷贝数的减少，并预防实验性的糖尿病神经病变，从而保护DRG神经元免受氧化应激的损伤。因此TFAM可作为研究线粒体生物合成调控机制的重要靶点之一。有研究表明冠心病患者中外周血mtDNA拷贝数较正常人明显减少，这种变化可作为氧化应激水平增加的指标，同时可用来评估冠心病的严重程度［8]。在对线粒体的调控中，相较于mtDNA来说TFAM的变化更早期、更直接，目前，尚未见冠心病与TFAM的相关报道，为此，本研究对冠心病患者外周血的TFAM mRNA进行了检测来证明TFAM的表达是否与冠心病密切相关。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2017年3-9月在承德医学院附属医院住院拟诊为冠心病无亲属关系，且无其他类型冠状动脉病变、心脏传导系统正常的患者，根据纳入及排除标准，共纳入92例患者，其中冠脉造影确诊为CHD（至少1支主要血管狭窄程度≥50%）患者56例为CHD组（男36例，女20例），36例冠状动脉造影阴性者为对照组（男19例，女17例）。

1.2 排除标准所有受试者均排除缩窄性心包炎、心脏瓣膜病、心力衰竭、心源性休克、严重肝肾功能不全、发热及感染、线粒体相关性疾病、近期重大手术外伤、各种恶性肿瘤、结缔组织病等。本研究获得我院伦理委员会批准，所有入选患者在研究前均签署知情同意书。

1.3 流行病学与临床资料收集记录研究对象的一般资料和既往病史，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、既往高血压及糖尿病病史。测量入院时身高、体重、血压（收缩压SBP、舒张压DBP），计算体质量指数（BMI）。临床指标测定：测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、静脉空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、尿酸（UA）、白细胞、中性粒细胞计数（neutrophil）、淋巴细胞计数（lymphocyte）及红细胞分布宽度（red cell distribution width，RDW），并计算中性粒细胞计数与淋巴细胞计数比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）。

1.4 实时定量PCR法检测TFAM mRNA水平所有研究对象均采集肘静脉血至少3 mL，以肝素钠抗凝，样品收集完成后，应用Qiagen血液基因组RNA提取试剂盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit），严格按试剂盒说明书进行操作提取2组血液样品中的RNA，应用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（FastQuant RT Kit）对所提取的RNA进行反转录；并应用Combasz 480实时PCR定量检测仪扩增TFAM和管家基因（GAPDH），获得TFAM的特异性扩增曲线和溶解曲线。引物序列为TFAM上游引物：5′-GCATCTGGGTTCTGAGCTTT-3′，下游引物：5′-CCGAGGTGGTTTTCATCTGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。反应体系（25μL）：ddH2O 9.0 μL，2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，PCR正向引物（55μmol/L）0.75μL，PCR反向引物（55μmol/L）0.75μL，待测cDNA模板（200 ng/μL）2μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，62℃退火20 s和72℃延伸20 s，共45个循环。实验数据应用目的基因Ct值与管家基因Ct值的比值作为每个标本TFAMmRNA的表达水平，其中Ct值为标本扩增到规定阈值时PCR循环数，Ct比值越大表示表达量越低。

1.5 冠状动脉血管病变支数及狭窄程度评价所有患者均以Judkins法行冠状动脉造影术，由两位心内科介入组医生进行诊断，若诊断结果出现不统一的情况下，另请一位介入医生进行诊断，全程采用盲法分析。记录冠状动脉有无狭窄等。将冠状动脉管腔狭窄≥50%纳入CHD组。

1.6 统计学方法采用统计软件SPSS19.0处理数据。计量资料正态性检验选Kolmogorov-Smirnova检验，符合正态分布，用均数±标准差表示，2组间均数比较选择t检验；计数资料用频数（百分比）表示，组间率或构成比的比较用χ2检验。采用Pearson相关分析以明确指标之间的相关性，TFAM mRNA与冠心病的相关性采用Spearman相关分析。冠心病的危险因素分析采用多因素Logistic回归分析，在单因素分析的基础上，选取有意义的（包括年龄、NLR、吸烟及TFAM mRNA的Ct比值）纳入多因素Logistic回归方程。上述均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

士人赞赏的态度固然激发了女性诗人更多的创作热情，对于士人反对的声音，女性诗人的心态与回应也不尽相同。部分女诗人自觉约束自己的行为，毁弃诗作，放弃写作，以合乎“规范”；另有一部分女诗人依然坚持写作，她们或私下进行，或公然反抗。

2 结果

2.1 两组临床资料、血液检测指标及外周血TFAM mRNA含量比较结果显示两组在性别、年龄、SBP、DBP、BMI、吸烟率、饮酒率、高血压患病率、糖尿病患病率方面差异无统计学意义（P＞0.05）；在冠心病组患者中，TFAM mRNA的Ct比值（1.39±0.06）高于对照组（1.35±0.08），即TFAM mRNA表达量低于对照组；NLR值（3.37±2.31）高于对照组（2.46±1.32）；淋巴细胞计数（24.77±8.40）低于对照组（29.04±7.47）；差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、2。

表1 两组患者基线资料的比较Tab.1 Comparison of the baseline datas between CHD group and control group

表2 两组患者血液检测指标的比较Tab.2 Comparison of the blood index between CHD group and control group ±s

表2 两组患者血液检测指标的比较Tab.2 Comparison of the blood index between CHD group and control group ±s

注：WBC，白细胞计数；Neu，中性粒细胞计数；Lym，淋巴细胞计数；RDW，红细胞分布宽度；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；FBG，静脉空腹血糖；BUN，尿素氮；Cre，肌酐；UA，尿酸；NRL，中性粒细胞计数与淋巴细胞计数比值；TFAM mRNA的Ct比值，目的基因Ct值与管家基因Ct值的比值

指标WBC（109/L）Neu（109/L）Lym（109/L）RDW（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）FBG（mmol/L）Cre（mmol/L）BUN（umol/L）UA（mmol/L）TFAMmRNA的Ct比值NLR对照组（n=36）6.61±1.50 62.83±9.28 29.04±7.47 42.26±2.78 4.25±1.09 1.95±1.23 1.16±0.27 2.28±0.76 6.29±2.37 64.33±14.24 5.63±1.55 324.07±93.18 1.35±0.08 2.46±1.32 CHD组（n=56）7.13±2.11 66.64±9.78 24.77±8.40 42.35±2.45 4.10±1.40 1.98±1.43 1.10±0.32 2.13±0.91 6.69±2.41 67.53±13.72 5.49±1.44 320.53±79.48 1.39±0.06 3.37±2.31 t值-1.302-1.880 2.483-0.163 0.539-0.105 0.957 0.835-0.782-1.069 0.451 0.195-2.664-2.139 P值0.196 0.064 0.015 0.871 0.591 0.917 0.341 0.406 0.436 0.289 0.653 0.846 0.009 0.035

2.2 相关性分析Pearson相关分析：TFAMmRNA的Ct比值与中性粒细胞计数、NLR呈正相关，分别为r=0.316、P=0.002，r=0.238、P=0.023；与淋巴细胞计数呈负相关，r=-0.323、P=0.002；则TFAM mRNA与中性粒细胞计数、NLR呈负相关，与淋巴细胞计数呈正相关。Spearman相关分析：TFAM mRNA的Ct比值与冠心病呈正相关，r=0.227、P=0.029，则TFAM mRNA与冠心病呈负相关。

2.3 多因素Logistic回归结果年龄（OR=1.058，95%CI：1.003 ～ 1.115，P=0.038）及 TFAM mRNA的 Ct比值（OR=2.358，95%CI：1.166 ～ 4.765，P=0.017）可能是冠心病的危险因素，而TFAM mRNA可能是冠心病的保护因素。见表3。

3 讨论

TFAM是由核基因编码的一种小分子多肽，能激活及调节线粒体转录及复制，并在氧化应激中起着重要作用。研究表明，在缺血再灌注心肌细胞中，TFAM水平明显下降，并且在已死亡心肌中TFAM表达消耗殆尽［9-10]。同时近期研究显示，可以通过检测外周血TFAM mRNA水平来预测关节疾病，且外周血TFAMmRNA的表达量与软骨细胞TFAM的表达量呈正相关（r=0.662，P＜ 0.01）［11]。因此本研究通过实时荧光定量PCR技术测定了56例CHD患者和36例对照组患者外周血TFAM mRNA的水平，发现CHD组与对照组相比，外周血TFAM mRNA表达量低，差异具有统计学意义。

表3 冠心病的多因素Logistic回归分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of CHD

在冠状动脉粥样硬化的发生发展过程中，内皮细胞功能障碍发挥着重要的作用［12]。近年来许多实验证明内皮细胞线粒体损伤和功能障碍可由氧化应激诱导［13-14]。氧化应激通过ROS的产生及脂质过氧化对动脉粥样硬化产生影响，从而引起血管的炎症反应。

线粒体作为细胞内ROS的主要靶点，ROS产生的增加诱导了mtDNA的显著损害［8]。研究表明线粒体DNA在线粒体能量代谢中起重要作用，因此线粒体DNA的改变（线粒体DNA的突变或者拷贝数的变化）都可能会导致氧化磷酸化障碍，增加ROS的产生或使线粒体生物合成减少。同时，上述改变反过来又会加速线粒体DNA的异常［15]。这种恶性循环最终会诱导线粒体功能障碍，从而导致细胞的凋亡［16]，这在动脉粥样硬化早期阶段具有重要意义［14]。既往进行了相关研究，发现了冠心病患者静脉血中mtDNA的变化趋势，而这种变化可能与TFAM存在一定的相关性。

TFAM作为线粒体生物合成的主要因子，具有诱导特定区域线粒体DNA结构改变的功能。目前研究显示，TFAM可调控DNA的转录、复制、重组及空间结构及线粒体ATP的产生［5]。另外多项研究表明，在氧化应激作用下，TFAM作为保护因子可以对抗ROS对细胞线粒体的损伤［9，17-18]，本研究Spearman相关性分析显示TFAM mRNA与冠心病呈负相关；多因素Logistic回归分析示TFAM mRNA为冠心病的保护性因素。因此，TFAM表达量的改变对mtDNA含量及线粒体功能具有重要的作用，这与既往所做的研究结论是一致的［19]，并且本研究显示与冠心病组相比，对照组中TFAM mRNA的表达量更高，由此，本研究推测外周血TFAM mRNA表达量与冠心病密切相关。

本研究是回顾性观察性研究，缺少干预。且选取病例数偏少，使得检验效能下降。本研究的患者均选自承德医学院附属医院心脏内科住院患者，未采用随机对照，存在选择偏倚。另外目前外周血TFAM mRNA没有确定的正常范围。

综上所述，冠心病与TFAM密切相关，但其与冠脉病变严重程度及冠心病的预后是否相关还需日后进行更深一步的研究。