脓毒症患者血清高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能的影响

安曙光 覃炳军 卢广轩 范彦琦 贾伯康

广东省东莞市人民医院ICU（广东东莞 523000）

脓毒症是一种由于感染所导致的全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），如果不进行及时治疗很容易发展为严重的脓毒症和多器官功能综合征［1-2]。2016年，第45届美国重症医学年会发布了“脓毒症-3”新定义及相应的临床诊断标准，将脓毒症定义为针对感染的宿主反应失调引起的致命性器官功能障碍。有研究人员的研究结果发现，大概有40%的脓毒症病人最后会发展为脓毒症性急性肾损伤（septic acute renal injury，SIAKI），其病死率能够达到70%左右［3-4]。因此进行及早的诊断以及及早的科学干预是缓解脓毒症以及预后的重点。SIAKI的发病机制比较复杂，具有较大的危害，研究可以早期以及有效可能够检测出患者肾损伤的生物学标志物具有十分重要的临床价值［5-6]。根据最近几年的研究结果表明，高迁移率族蛋白Bl（high mobility group box-1 protein，HMCBl）属于一类十分关键的晚期炎症介质，与脓毒症的病理生理过程具有直接关系，可能是一种有效的干预指标之一，但目前对其与机体免疫功能之间的联系的研究较少［7-8]。本研究深入研究了脓毒血病人血清HMGBl水平的变化与机体T细胞免疫功能之间的关联，探索了脓毒血病人免疫功能异常的发病机制。

1 对象和方法

1.1 研究对象和分组观察组选取2015年1月至2017年5月间在我院ICU科的不同程度的80例脓毒症患者。80例患者中有37例脓毒症患者，43例严重脓毒症患者（其中休克患者有11例）。脓毒症的诊断根据2001年美国危重病医学会、欧洲危重病医学会、美国胸科医师协会以及美国胸科学会外科感染学会联席会议有关全身性感染定义国际会议所制定的标准。对照组选择同期其他病区（神经内科、普外科、心内科）的住院患者80例，所有受试者都没有感染等并发症出现。按照脓毒症患者的预后情况，进一步将脓毒症患者分为死亡组与存活组，其中死亡组23例，采集血标本，存活组57例。

1.2 方法

1.2.1 样品准备对所有受试者的血样进行收集，采取含乙二胺四乙酸（EDTA-K2）的无致热原试管（美国BD公司产品）对静脉血进行收集，每管5 mL，采用2 500 r/min进行20 min离心，对患者的血浆进行分离。将血细胞与同体积的无菌生理盐水进行混合，将此血细胞悬液慢慢放置在无菌以及无致热原的聚蔗糖一泛影葡胺液面上，在18～20℃的条件下进行2 500 r/min的20 min离心，对第二层云雾状的低密度细胞进行吸取收集，离心洗涤后将红细胞进行去除。采取单核细胞以及多形核细胞能够粘附塑料以及毛细玻璃的特点，然后进一步将T淋巴细胞进行分离和纯化。

1.2.2 观察指标（1）血清HMGBl水平的检测：取患者的血清100μL，采取人HMGBl酶联免疫吸附试验（EUSA）试剂盒（日本Shjno-Test公司）进行检测，完全根据说明书进行操作，分别计算出标准曲线以及回归方程，将样品吸光度值代入标准曲线，然后计算出病人的血清HMGBl水平。（2）采取噻唑蓝法对T淋巴细胞增殖活性进行检测：采取包含体积分数为20%胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调整到2×106/mL，取0.1 mL细胞于96孔培养板进行接种，然后添加100μL植物血凝素对其进行刺激。在37℃、5%的CO2孵箱中反应68 h，将100μL上清进行吸弃，然后再向各孔添加5 mg/mL的MTT 10μL，轻轻混合均匀，在37℃、5%的CO2孵箱中继续孵育4 h。然后再添加100μL的曲通异丙醇溶液，在37℃、5%的CO2孵箱中反应过夜，测定波长为540 nm的吸光度值（A值）。（3）细胞培养上清中白细胞介素-2（IL-2）含量测定：采用人IL-2 ELISA试剂盒（北京晶美生物公司产品）进行测定；（4）流式细胞仪检测CD4+/CD8+T细胞比值：将分离好的外周血单个核细胞用磷酸盐缓冲液调整到1×106/mL，吸取100μL悬液放到人流式管内，再添加CD8-藻红蛋白（PE）20μL以及CD4-U藻蓝素（APC）20μL，在避光的条件下混合均匀，反应15 min后，再添加400μL磷酸盐缓冲液。采取流式细胞仪进行测定（流式细胞仪和所有荧光标记抗体都购自美国BD公司）。

1.3 统计学方法本研究中数据全部采用SPSS 20.0统计分析软件（美国IBM公司）进行处理；计量资料采用均数±标准差表示；多组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示；多组间比较采用χ2检验；P＜0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 受试者一般资料三组患者在年龄、性别、体重及身高上的指标上差异均无统计学意义（均P＞ 0.05），具有可比性，见表1。

2.2 受试者血清高迁移率族蛋白B1表达与脓毒症严重程度的关系对照组外周血淋巴细胞HMGBl表达量为（5.11±1.30）ng/mL，与对照组进行比较，脓毒症组、严重脓毒症组患者淋巴细胞基因表达HMGBl明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。三组不同程度脓毒症患者之间，组与组进行比较具有明显差异，见表2。

2.3 受试者T淋巴细胞增殖反应变化对照组T淋巴细胞增殖的A值为（0.99±0.41），与对照组进行比较，脓毒症组、严重脓毒症组患者T淋巴细胞增殖明显受到抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05）。三组不同程度脓毒症患者之间，组与组进行比较具有明显差异，见表3。

表1 三组患者基本资料情况比较Tab.1 Comparison of basic data in three groups of patients ±s

表1 三组患者基本资料情况比较Tab.1 Comparison of basic data in three groups of patients ±s

分组脓毒症组严重脓毒症组对照组F（χ2）值P值例数37 43 80--年龄（岁）51.22±8.16 52.35±7.59 52.50±7.14 6.552 0.212性别（男/女，例）21/16 23/20 43/37 3.562 0.351体重（kg）64.51±11.62 66.07±12.88 65.20±14.16 4.521 0.265身高（cm）165.51±6.92 168.31±6.28 166.60±6.35 5.182 0.599

表2 受试者血清HMGBl表达与脓毒症严重程度的关系Tab.2 Relationship between serum HMGBl expression and severity of sepsis in subjects ±s

表2 受试者血清HMGBl表达与脓毒症严重程度的关系Tab.2 Relationship between serum HMGBl expression and severity of sepsis in subjects ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05

分组脓毒症组严重脓毒症组对照组F值P值例数37 43 80--HMGBl值（ng/mL）23.15±4.21*25.24±4.33*5.11±1.30 12.10 0.001

表3 受试者T淋巴细胞增殖反应变化Tab.3 The changes in T lymphocyte proliferation reaction in subjects ±s

表3 受试者T淋巴细胞增殖反应变化Tab.3 The changes in T lymphocyte proliferation reaction in subjects ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05

分组脓毒症组严重脓毒症组对照组F值P值例数37 43 80--T淋巴细胞增殖（A值）0.41±0.27*0.39±0.23*0.99±0.41 15.96 0.001

2.4 受试者T淋巴细胞分泌IL-2变化对照组T淋巴细胞分泌IL-2水平为（19.35±5.41）pg/mL，与对照组进行比较，脓毒症组、严重脓毒症组患者T淋巴细胞分泌IL-2水平明显受到抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05）。三组不同程度脓毒症患者之间，组与组进行比较具有明显差异，见表4。

2.5 受试者CD4+/CD8+T细胞比值的变化对照组CD4+/CD8+T细胞比值为（1.39±0.11），与对照组进行比较，脓毒症组、严重脓毒症组患者T淋巴细胞分泌IL-2水平明显受到抑制，差异具有统计学意义（P＜0.05）。三组不同程度脓毒症患者之间，组与组进行比较具有明显差异，见表5。

表4 受试者T淋巴细胞分泌IL-2变化Tab.4 The changes in IL-2 secretion by Tlymphocytes in subjects ±s

表4 受试者T淋巴细胞分泌IL-2变化Tab.4 The changes in IL-2 secretion by Tlymphocytes in subjects ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05

分组脓毒症组严重脓毒症组对照组F值P值例数37 43 80--T淋巴细胞分泌IL-2水平（pg/mL）10.03±3.37*8.95±3.31*19.35±5.41 15.02 0.002

表5 受试者CD4+/CD8+T细胞比值的变化Tab.5 Changes in the ratio of CD4+/CD8+Tcells in the subjects ±s

表5 受试者CD4+/CD8+T细胞比值的变化Tab.5 Changes in the ratio of CD4+/CD8+Tcells in the subjects ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05

分组脓毒症组严重脓毒症组对照组F值P值例数37 43 80--CD4+/CD8+T细胞比值1.11±0.09*1.02±0.08*1.39±0.11 11.12 0.006

2.6 受试者血清HMGBl基因表达与受试患者预后的关系对脓毒症患者死亡组及存活组的血清HMGBl基因表达进行比较，结果表明，死亡组患者淋巴细胞HMGBl基因表达明显高于存活组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 受试者血清HMGBl基因表达与受试患者预后的关系Tab.6 Relationship between serum HMGBl gene expression and prognosis of subjects ±s

表6 受试者血清HMGBl基因表达与受试患者预后的关系Tab.6 Relationship between serum HMGBl gene expression and prognosis of subjects ±s

注：与死亡组比较，*P＜0.05

分组存活组死亡组t值P值37 80--27.51±4.21*40.59±5.47 6.752 0.001例数HMGBl值（ng/mL）

3 讨论

近年，很多关于抗炎治疗的临床试验并没有取得预期的结果，脓毒症后并发症的发病率和病死率依然持续升高［9]。目前研究人员的研究结果表明，作为一种晚期炎症介质，高迁移率族蛋白B1与脓毒症的病理生理过程具有直接关系，属于一种细菌和其毒素致死反应的关键晚期细胞因子，其为进一步研究脓毒症的发病机制与干预方法提供了新的治疗靶点［10]。

本研究结果表明，脓毒症组、严重脓毒症组患者淋巴细胞基因表达高迁移率族蛋白B1明显升高。且随着脓毒症严重程度的加深，高迁移率族蛋白B1水平也明显升高，提示高迁移率族蛋白B1水平与脓毒症患者的严重程度具有直接的关系。目前关于脓毒症患者的高迁移率族蛋白B1合成以及释放的具体机制还没有完全明确，推测可能与急性应激状态下，细菌内毒素移位以及早期细胞因子具有直接关系［11]。脓毒症病人在6～24 h内，肝、肺及小肠组织的高迁移率族蛋白B1基因表达明显升高，说明局部组织高迁移率族蛋白B1的产生与内毒素介导的器官功能损伤具有密切的关系密切［12]。通过进一步的研究表明，采取高迁移率族蛋白B1合成抑制剂能够有效预防脓毒症的发生发展并能对其发展过程进行阻滞，并在不同程度上明显改善组织的损伤程度以及缓解动物预后情况。因此，高迁移率族蛋白B1这个“晚期”细胞因子可能与脓毒症的发生发展病具有直接关系，进行及早的干预，可能有效的帮助脓毒症的临床治疗，并减少致死率以及并发症的发生发展［13]。本研究观察到，与对照组进行比较，脓毒症组、严重脓毒症组患者T淋巴细胞增殖明显受到抑制。这表明脓毒症患者的T细胞免疫功能受到十分严重的损伤，对患者的T淋巴细胞免疫功能进行动态检测，对监测脓毒症的病情的变化可能存在一定程度上的临床意义。本研究还表明，与对照组进行比较，脓毒症组、严重脓毒症组患者T淋巴细胞分泌IL-2水平明显受到抑制。这表明在脓毒症患者的外周血T淋巴细胞增殖能力与IL-2产生能力一直处在受抑制的状态，其中以严重的脓毒血患者尤其明显。研究发现，脓毒症病人的纯化的CD8+T细胞增殖能力高于CD4+T细胞，推测可能与前列腺素刺激CD8+T细胞的生产、降低IL-2的水平以及阻滞T细胞增殖具有一定关系。高迁移率族蛋白Bl作为一种细胞核内非组蛋白，全程参与了脓毒症患者的病理发展过程，并成为脓毒症潜在的重要干预靶点之一。然而，高迁移率族蛋白B1与机体免疫功能间的关系尚不清楚［14]。另外，丙酮酸乙酯能够通过抑制高迁移率族蛋白B1的释放从而缓解患者淋巴细胞的功能出现紊乱，即能够明显提升脾淋巴细胞的增殖能力以及IL-2的产生，从而有效缓解脓毒症病人的细胞免疫功能障碍。

通过上述的研究结果表明，高迁移率族蛋白B1不仅属于一类体内关键的晚期促炎症因子，而且还可能与脓毒症病人的机体T细胞免疫功能紊乱具有一定程度上的关系，但其具体的作用机制还需要进行进一步的研究探讨。